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文档之家› 【CN109627322A】一种从Cohn组分上清中分离纯化人血清白蛋白的方法【专利】
【CN109627322A】一种从Cohn组分上清中分离纯化人血清白蛋白的方法【专利】
技术领域 [0001] 本发明属于生物技术领域,涉及一种从Cohn组分Ⅴ上清中分离纯化人血清白蛋白 的方法。
背景技术 [0002] 人血清白蛋白(Human Serum Albumin ,HSA)是血浆中含量最丰富的一种蛋白质, 约占 血浆蛋白 总含量的 60% 左右。在人体内 ,血清白蛋白的 主要生理功能是维持血液渗透 压 和携带血液中 多 种配基 (包括脂肪酸 、氨基酸 、类固醇 、金 属离子及药物) 与组织进行交 换,临床用于手术输血和危重病人补液,治疗创伤休克、发烧、水肿和低白蛋白血症等,而且 能增强人体抵抗能力,是目前临床用量最大的药用蛋白。 [0003] 目前人血清白蛋白的制备主要采用低温乙醇沉淀工艺,其主干通常是Cohn法或其 变法或简法。大规模生产中先将血浆蛋白 分成几个大的组分 ,再从其中分离出不同的 药 用 蛋白。其中组分I中主要成分为纤维蛋白原、VIII因子等,组分II主要为丙种球蛋白 ,组分 III主要为α及β球蛋白 ,组分IV主要为α及β球蛋白 、转铁蛋白等 ,组分Ⅴ主要为白蛋白。 [0004] 在CN104004084A、CN103394076A、US5346992A、US5250662等公开的工艺中,白蛋白 的分离主要以冷乙醇沉淀法得到组分V沉淀为原料,进一步结合沉淀、超滤或层析等技术提 高纯度。在沉淀过程中 ,白蛋白的收率较低 ,部分白蛋白随组分I、组分II、组分III和组分IV 沉淀而流失,还有一部分白蛋白残留于组分V上清中。从组分I、组分II、组分III和组分IV沉 淀中回收白蛋白的方法均有报道,例如从Kistler-Nitchmann工艺组分IV沉淀中回收白蛋 白 (刘鹏翰 ,从低温乙醇法FIV组份中分离人血白蛋白的研究 .药物生物技术 ,1997(02): p .114-117 .) ;苏志国等以Cohn组分IV为原料,提取人血清白蛋白(CN102977180A) ;张林等 从低温乙醇沉淀组分I+II+III中回收白蛋白 (CN102311496A) 。组分Ⅴ上清则作为废液被丢 弃或用于回收乙醇,目前为止未见从组分V上清中分离纯化白蛋白的报道。 [0005] 有部分工艺不进行组分V沉淀,即以组分IV沉淀后所得上清为原料,经超滤脱醇后 得到白蛋白。如采用多步浓缩和超滤脱醇 ,可以 将白蛋白浓度提高以达到富集的目的 ,同时 使乙醇残留降 到较低水平 (刘隽湘 ,输血疗法与血液制品[M] ,北京 ,人民 卫生出版社 , 1996) 。但是该工艺需要使 用大量缓冲液稀释原液 ,并且超滤操作时间长 ,长时间处于较高 浓度的乙 醇中不利于蛋白 活性的 保持。虽 然通过降 低超滤膜的 截留率可以 提高 操作速率 , 但是却对蛋白收率有很大影响。另一方面 ,超滤法对白蛋白的纯化作用有限 ,无法有效分离 与白蛋白 分子量 相近的 杂蛋白 。CN105037487A公开了一种人血白蛋白的 制备方法 ,以 健康 人血浆上清为原料 ,采 用Kistler-Nitchmann低温乙 醇法沉淀 、分离组分I+II+III 和组分 IV ,对组分IV分离后上清液进行脱醇处理 后 ,再配合一步离子交换层析 ,超滤 ,加入适量的 辛酸钠作为稳定剂 ,经巴氏 病毒灭活处理后得到人血白蛋白成品。经高效液相色谱法检测 该工艺制备的人血白蛋白的纯度≥99%,多聚体含量≤1%,收率达到28~30g/L血浆。制品 的纯度更高 ,杂蛋白 含量更低 ,使得临床 用药更加安全。但是此方法缓冲液 用量大 ,操作时 间长。
权利要求书2页 说明书5页 附图2页
CN 109627322 A
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权 利 要 求 书
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1 .一种从Cohn组分Ⅴ上清中分离纯化人血清白蛋白的方法,其特征在于,包括以下步 骤 :将Cohn组分Ⅴ的上清液上样至含有阴离子交换层析介 质的 层析柱中 ,使 用洗脱液洗脱 层析柱,收集洗脱液得到人血清白蛋白。
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权 利 要 求 书
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清白蛋白;最后使用清洗液清洗层析柱,其中清洗液为含有浓度为0 .2~1M的氯化钠的pH值 为4 .0~6 .0、浓度为20~100mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。 Nhomakorabea3
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说 明 书
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一种从Cohn组分Ⅴ上清中分离纯化人血清白蛋白的方法
本发明提供了一种从Cohn组分Ⅴ上清中分 离纯化人血清白蛋白的 方法 ,包括以 下步骤 :将 Cohn组分Ⅴ的上清液上样至含有阴离子交换层 析介质的层析柱中 ,使用洗脱液洗脱层析柱,收 集洗脱液得到人血清白蛋白 ;本方法首次提出以 低温乙醇沉淀组分V上清为原料分离纯化白蛋白 的 新思路 ,不采 用超滤工艺脱除乙 醇 ,从而大大 降 低了缓冲液 用量 ,减少操作时间 ,避免了蛋白 长时间在较高乙醇溶液中的变性失活问题,具有 操作简单,成本低廉,过程耗时短,蛋白活性收率 高等优点。利用本发明方法可以对组分Ⅴ上清中 的白蛋白进一步回收 ,有效提高血浆利用率,降 低成本,对于实际应用具有重要的价值。
( 19 )中华人民 共和国国家知识产权局
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910012824 .3
(22)申请日 2019 .01 .07
(71)申请人 中国科学院过程工程研究所 地址 100190 北京市海淀区中关村北二街1 号
(72)发明人 罗坚 苏志国 陈颖 向杰
(74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司 11332
2 .根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述阴离子交换层析介质的孔径为10~ 90nm;
优选地,所述阴离子交换层析介质的间隔臂包含3~12个碳原子; 优选地,所述阴离子交换层析介质包括DEAE Sepharose Fast Flow、QSepharose Fast Flow、Capto Q、Capto DEAE、Capto Q XP或Fractogel EMD TMAE中的任意一种。 3 .根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,将Cohn组分Ⅴ的上清液上样前,还包括 使用平衡液平衡阴离子交换层析介质; 优选地,所述平衡液为磷酸盐缓冲液; 优选地,所述磷酸盐缓冲液的浓度为20~100mM; 优选地,所述磷酸盐缓冲液的pH值为6 .0~8 .0。 4 .根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其特征在于,所述Cohn组分Ⅴ的上清液pH值 与平衡液的pH值相同。 5 .根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于,所述上样结束后,还包括使用 平衡液淋洗层析柱; 优选地,所述淋洗使用的平衡液的体积为3~10倍柱体积。 6 .根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于,所述洗脱液为柠檬酸-柠檬酸 钠缓冲液; 优选地,所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为20~100mM; 优选地,所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH值为4 .0~6 .0。 7 .根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其特征在于,所述收集洗脱液后,使用清洗 液清洗层析柱; 优选地,所述清洗液为含有氯化钠的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液; 优选地,所述氯化钠在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的浓度为0 .2~1M; 优选地,所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为20~100mM; 优选地,所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH值为4 .0~6 .0。 8 .根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其特征在于,所述洗脱液进行超滤浓缩并置 换缓冲液得到人血清白蛋白。 9 .根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述超滤浓缩为使用超滤膜将洗脱液进行 超滤; 优选地,所述超滤膜的截留分子量为10~30kDa。 10 .根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:使用体积为3 ~10倍柱体积、浓度为20~100mM、pH值为6 .0~8 .0的磷酸盐缓冲液平衡孔径为10~90nm、 间隔臂包含3~12个碳原子的阴离子交换层析介质,将Cohn组分Ⅴ的上清液上样至含有阴 离子交换层析介质的 层析柱中 ,其中Cohn组分Ⅴ的上清液与磷酸盐缓冲液pH值相同 ,然后 使用浓度为20~100mM、pH值为4 .0~6 .0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗脱层析柱,收集洗脱 液,将洗脱液使用截留分子量为10~30kDa的超滤膜进行超滤浓缩并置换缓冲液,得到人血
代理人 巩克栋
(51)Int .Cl . C07K 14/765(2006 .01) C07K 1/18(2006 .01)
(10)申请公布号 CN 109627322 A (43)申请公布日 2019.04.16
( 54 )发明 名称 一种从Cohn组分Ⅴ上清中分离纯化人血清
白蛋白的方法 ( 57 )摘要