凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤
凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤
实验目的：凝血酶滴定法测定水蛭素活性含量
实验仪器和试剂：电子天平酸度计离心机移液器 45度试管架
三羟甲基氨基甲烷（Tris）盐酸（Hcl）生理盐水蒸馏水凝血酶纤维蛋白原及常用玻璃仪器
实验步骤：
1、称取1.21g三羟甲基氨基甲烷加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml，浓度为0.2mol/L。

2、用移液器取429ul盐酸加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml，浓度为0.1ml/L。

3、从1去25ml，从2取40ml混合调PH到7.4（用1或2调），加蒸馏水定溶到100ml。

4、称取样品1g放入试管加生理盐水5ml充分溶解30分钟。

5、把4放入离心机离心10分钟，4000转/分。

6、取3（Tris缓冲液）1.6ml，稀释纤维蛋白原0.008g，浓度
0.5%。

7、用生理盐水配制40u/ml的凝血酶溶液。

8、从5取上清液100ul。

9、从6取200ul加入8充分摇匀后，吹一小气泡。

10、从7每分钟取5ul加入9迅速摇匀后，匀速转动试管，观察反应，溶液上的小气泡随液面转动时视为反应的终点（记录好滴加凝血酶的次数）。

11、计算公式为：2
211V C V C U
其中
C 1=凝血酶的浓度
C 2=样品的浓度 V 1=滴加凝血酶的体积
V 2=取样的体积
注：
1、滴加次数超过5次还不凝固的，应按一定倍数稀释样品。

2、为了提高滴定的准确度可梯度配用不同浓度的凝血酶溶液。

3、为了提高滴定的准确度同时也可在临近凝固的下一次滴加凝血酶5u/次，改为4u/次，3u/次，2u/次，1u/次。

4、如果样品是溶液，直接取样100ul 检测，检测步骤和计算方法不变。

5、如果样品是可溶性粉状物，加溶液溶解后，取溶液100ul 检测，检测步骤和计算方法不变。