课程名称：生物医学实验同组学生姓名：指导老师：应李强成绩：
实验名称：基因表达检测的相关实验技术和蛋白印迹技术实验类型：生物化学
一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）
三、主要仪器设备（必填）四、操作方法和实验步骤
五、实验数据记录和处理六、实验结果与分析（必填）
七、讨论、心得
一、实验原理
电泳是指带电颗粒在电场中的泳动。

许多重要的生物分子如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都含有可电离基团，在非等电点条件下带有电荷，在电场力的作用下，它们向着与其所带电荷相反的电极移动。

电泳技术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。

可用于样品的制备、纯度鉴定、分子量测定等。

蛋白质印迹技术（western blotting）
又称免疫印迹技术和western印迹技术，是鉴别蛋白质的分子杂交技术
原理：将经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品转移到固相载体上。

以固相载体上蛋白质或多肽作为抗原，与对应的未标记的一抗起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗反应。

经过底物显色、化学发光或放射自显影，检测特异基因表达的蛋白成分的存在和含量。

该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二抗标记物
常用的二抗标记物有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等，辣根过氧化物酶最敏感的底物是3,3’-二氨基联苯胺，它在过氧化物酶所在部位被反应转变成棕色沉淀。

在钴或镍离子存在下进行反应可以加深沉淀的颜色并提高反应的灵敏度。

但是，使用辣根过氧化物酶不可能完全排除背景颜色，因此须十分小心地观察生色反应，一旦特异性染色蛋白带清晰可见，就应尽快终止生色反应。

碱性磷酸酶可催化底物5一溴-4-氯-3-引哚磷酸／氮蓝四唑(BCIP／NBT)在原位转变为深蓝色化合物。

这是利用二抗标记物进行的显色反应，是最早的Western Blotting检测方法，现在主要用于免疫组化，在显微镜下观察。

该方法的灵敏度相对较低，可以检测ng水平的目标蛋白。

Western blotting 蛋白显影方法
1．增强化学发光法(ECL)
ECL化学发光检测试剂是基于Luminol的新一代增强型化学发光底物试剂，它由辣根过氧化物酶（HRP）催化发生化学反应，发出荧光，结果可以通过X光片压片和其它显影技术展现，或使用Luminometer检测。

溶液A主要成分为Luminol及特制发光增强剂，溶液B主要成分为H2O2及特殊稳定剂。

发光液A和B在HRP的催化作用下Luminol与H2O2反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。

在激发过程中不需要消耗HRP，HRP只是起催化作用，所以只要HRP没有降解失活，是可以重复加发光液的。

ECL化学发光检测灵敏度较高，可以检测pg水平的目标蛋白。

Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类：主要是鲁米诺（luminol）及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。

在Ecl底物中，含有鲁米诺（溶液A）和H2O2 （溶液B），在HRP（辣根过氧化物酶）催化
剂的作用下，发出荧光来。

HRP不消耗。

注意：荧光在一段时间后会越来越弱。

2.DAB 显色
DAB （3,3二氨基联苯胺）和HRP 反应产生棕色的不溶终产物。

这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用复染和免疫组化染色特别理想。

对于碱性磷酸酶（AP ）标记的二抗，则选用BCIP 和 NBT 显色，在AP 作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。

二、实验步骤
①SDS-PAGE 电泳分离待检测蛋白质
安装垂直板型电泳装置→干净的小烧杯中按所列的试剂用量配制(所列试剂见表1)→ 注胶至红线下方，上用蒸馏水覆盖→在另一个干净的小烧杯中配置浓缩胶(配方见表2)→ 待胶凝固后电倒去水层，注入浓缩胶→凝固后将电极缓冲溶液倒入上、下贮槽中没过短玻璃片→ 在样品凹槽内按下列表格加样→插入电源开始电泳(开始时30V ，后为60V ，电泳2h)→
牛血清蛋白/10μL
样品2/15μL 样品1/15μL Maker/15μL
样品1/15μL
样品2/15μL
牛血清蛋白/10μL
表1 12％分离胶浓度10ml 体积配制量 表2 4.5％分离胶浓度5 ml 体积配制用量
30%凝胶贮液 4.0ml 分离胶缓冲液 1.25ml 10% SDS 0.1ml ddH2O 4.0ml 10%过硫酸胺 0.06ml 2%TEMED 0.6 ml
②转膜
凝胶片取出进行转膜→带上手套将凝胶片放在装有转膜夹的转膜缓冲液中→按照转膜夹黑色面（负极）－海绵垫－滤纸－胶－ 膜 －滤纸－海绵垫－红色面（正极）的顺序进行安放，PVDF 膜需要用甲醇激活（15S ），在此过程中要排气泡→用塑料夹夹紧后放入转移电泳装置，将电泳槽搁置冰上，90V 恒压1小时（转膜后的P V D F 膜晾干后在4℃冰箱中保存一周）→ ③封闭、抗体结合、显色
30%凝胶贮液 0.75ml 分离胶缓冲液 0.83ml 10% SDS 0.1ml ddH2O 3.0ml 10%过硫酸胺 0.03ml 2%TEMED
0.3 ml
剪膜（检测蛋白为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），大小约为36kDa，因此根据预染蛋白marker提示剪取36kDa上下共约3条预染蛋白大小宽度）甲醇激活，TBST漂洗→封闭（封闭液：5%脱脂牛奶，TBST ），室温，1小时（摇床上），TBST淋洗→一抗反应，室温孵育，1小时→洗涤：TBST，3次，每次10min→二抗反应，室温孵育，1小时→洗涤：TBST，3次，每次10min→ECL显色：A，B化学发光液各0.5ml混合，放入膜，反应2min后于化学发光检测仪上进行观察
三、实验数据
第二条是我们组的实验，从显色图中我们可以清晰的看出有四条带，分别是样品2、样品1、样品1、样品2，而且由于样品1的浓度大于样品2，因而样品1的亮度更亮些，完全与事实相符。

所以，总的说来，这次实验还是很成功的。

四、讨论
①注意事项
1.转膜时，PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液平衡。

2.整个转膜过程中注意排尽气泡。

3.从转膜完毕起，以后所有的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。

4.在摇床上培养时，注意船是否破裂，以致封闭液或者一抗、二抗未能没过膜，从而产生实验误
差或失败。

5.在用TBST淋洗时，注意一定要洗干净，从而保持良好的特异性。

②实验感悟
1.在整个实验过程中，由于是两组合作，而且实验较简单，导致，整个实验可能并不需要所有人
都动手操作。

2.整个实验简单，且在摇床上时间很长，而这一阶段的时间并没有很好地利用。

3.在膜的左上角剪一下，便于确定膜的正反面。

③思考题
1.三种固相载体膜的优缺点。

①硝酸纤维素（NC）膜：
优点：与蛋白质之间靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉（三种膜中最便宜），使用方便。

灵敏度和分辨率教高，背景低。

缺点：结合在NC 上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；NC韧性较差，易损坏。

②聚偏二氟乙烯(PVDF)膜：
优点：灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。

机械强度高，背景低。

缺点：价格昂贵。

③尼龙膜：
优点：灵敏度、分辨率也叫高，软而结实，价格较便宜。

缺点：背景较高
2.用PVDF转膜时，为什么需要用甲醇激活？
活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。

3.高背景出现的原因有哪些，以及解决方法？
①抗体浓度太高，优化降低一抗、二抗的浓度。

②抗体孵育温度过高，采用4℃孵育。

③封闭不充分，延长封闭时间，更换合适的封闭剂。

④漂洗不完全，增加漂洗时间和缓冲液体积，或者漂洗液中加入浓度0.05%Tween20
4.信号弱或者无信号的原因?
转膜不完全, 蛋白质与膜结合不充分, 过度封闭, 膜没有完全均匀湿透甲醇浓度过高。