生物工程大实验30L发酵罐上黄原胶发酵实验姓名：学号：学院：生命学院专业：生物工程年级：同组成员：1.材料和方法1.1菌株：HYJ1.2培养基1.2.1斜面培养基（100ml）葡萄糖 3.0；蛋白胨0.5；酵母粉0.3；氯化钠0.5；琼脂 2.0；pH 7.0-7.3灭菌条件：115℃，20min；培养温度：30℃；培养时间：24-48 h1.2.2种子培养基（100ml）葡萄糖 2.0；蛋白胨0.5；酵母粉0.1；牛肉膏0.3 g；pH 7.0-7.3灭菌条件：115℃，20 min；培养温度：30℃；培养时间：10-15 h1.2.3发酵培养基（100ml）葡萄糖 3.0；蛋白胨0.2；酵母粉0.1；Na2HPO4·12H2O 0.252；KH2PO4 0.3；K2SO4 0.1；MgSO4·7H2O 0.1；pH 7.0-7.3灭菌条件：115℃，20 min；培养温度：30℃；培养时间：48-62 h1.3. 培养条件1.3.1斜面培养1）配置400 ml的斜面培养基，分装试管，于115℃下灭菌20 min，之后摆斜面，冷却至室温后，将凝固后的斜面放于30℃培养箱过夜。
2）转接斜面菌种，将转接好的斜面菌放于30℃培养箱培养24-48 h。
1.3.2一级种子培养1）配置种子培养基：按照种子培养基配方配制3000 ml，分别分装到5000 ml 和500 ml的三角瓶中，装液量分别为100 ml/500 ml三角瓶（用于一级种子培养）；1000 ml/5000 ml三角瓶（用于二级种子培养），于115℃下灭菌20 min。
2）接种：将培养好的斜面菌种接种到一级种子培养基中（100 ml/500 ml三角瓶），接种量为每瓶2-3接种环，放在30℃摇床培养10-15 h，转速为200 rpm。
1.3.3二级种子培养将培养好的一级种子接种到二级种子培养基中（1000 ml/5000 ml三角瓶），接种量为10%（v/v），放在30℃摇床培养6-8 h，转速为200 rpm。
1.3.4发酵罐培养1）配置发酵培养基20 L，考虑到接入的种子液的体积（10%, 2000 ml），所以培养基配置定容时为18 L。
2）将培养好的二级种子接种到发酵罐中，接种量为10%（v/v），温度30℃，发酵罐初始搅拌转速约为100 rpm，通风量1.5-2.0 vvm，初始pH为7.0-7.3，中间过程不控制pH。
1.4 检测方法1.4.1发酵液OD取一定体积的发酵液进行适当稀释，然后用分光光度计在620 nm波长下测定吸光度。
1.4.2葡萄糖含量取一定发酵液进行适当稀释，8000 rpm/min 离心15 min，取上清，采用SBA 检测。
1.4.3发酵液粘度发酵过程中取大约100 ml发酵液，用Blankspoon粘度计(DV-E，VISCOMETER)测定其粘度。
1.4.4黄原胶产量测定发酵结束后取10 ml发酵液，用3倍体积无水乙醇沉淀黄原胶，8000 rpm/min 离心15 min，去上清，沉淀的黄原胶50℃通风箱内干燥至恒重，用分析天平称重。
1.4.5 pH值测定用pH计测定发酵液的pH值。
1.4.6菌体干重的测定取发酵液10 ml加入20 ml去离子水稀释，放置在80℃水浴锅中用1 mol/l NaOH调节pH10后，水浴15 min，然后再用1 mol/l HCl调节pH7.0，迅速12000 rpm离心20 min，去上清，留沉淀，于50℃通风箱内干燥至恒重（8-10 h）。
1.4.7计划取样时间及待测参数：前24 h发酵过程中，每隔4 h取一次样测定pH、发酵液OD、黄源胶产量、菌体干重，葡萄糖含量、发酵液粘度。
2. 结果与讨论2.1实验图片其中A为斜面上菌的镜检图B为二级种子镜检图C为28.5h镜检图D为70h镜检图2.2 30L发酵罐上的发酵曲线a)发酵曲线汇总b)菌干重上图为菌干重数据以及拟合曲线（OD实际也是反映菌体浓度，因此在此不做讨论），可以看出实际的数据与拟合曲线拟合的并不是很好。
而且我们由于接种量比较大，为15%的接种量，且经过二级种子的培养也没有延迟期，故最大生长速率应该在20h左右，但由于发酵液后期产胶过大，粘度过大，而我们分离菌的方法比较简单原始，故后期很难将菌从发酵液中分离下来，故后期所测的菌的干重实际是菌和部分胶的重量，后期数据不准因而导致实验结果误差较大。
c)胶干重曲线其中A为原始数据作图，B为删掉0小时数据作图在0h我们取样时可能未等发酵液混匀后便取，因而测得的胶干重数据异常，可以看出A图数据拟合的并不是很好，在B图中我将0h胶干重设为0，可以看出拟合度大大提高。
从数据来看，胶干重测量还是不错的，当然由于提取胶的方法比较简单，会有部分菌带到胶中，这也是不可避免的误差。
可以看出在15小时左右时胶的产生速率最大，而到30小时左右时胶的产生速率有所下降并在逐渐降低，这与底物的消耗、溶氧的降低等因素有关。
d)残糖曲线从图中可以看出所测的数据与拟合直线拟合的较好，这证明实际的操作比较规范。
从一开始糖的消耗来看，消耗量较小，原因可能是菌种有延迟期；但从8h开始，糖的消耗量迅速增加，到30h左右残糖量已经到了一个较低的值，这证明在这段时间内菌体大量繁殖消耗了糖分。
到发酵后期，发酵液中溶氧量和菌对糖的消耗量处在一个很低的水平，此时菌体进入衰退期。
e)溶氧曲线在最初的4个小时内通风量变化不大，转速也较低的情况下氧变化比较小，因为此时菌体处于适应期，没有大量繁殖，消耗的氧气不多。
在对数生长的初期，比耗氧速率达到最大值，但此时细胞浓度还很低，摄氧率并不高。
随着细胞浓度的迅速增高，培养液的摄氧率也迅速增高，并在对数生长的后期达到峰值。
于是表现为发酵液中溶氧迅速降低，最后低至负值。
由于接种量为15%，比一般接种量偏大，所以菌体生长及产生速度也偏快，因此在最初的10h内溶解氧就降到了一个很低的水平。
之后由于培养基中营养物质的消耗，以及培养装置氧传递能力的限制，到对数生长阶段结束，溶氧已经降到了一个极低的水平，虽然细胞浓度可能还会有所增加，但溶解氧量也不会再升高。
此后，由于本实验菌种产生的黄原胶分子量较大，粘度较大，因此即使再加大通风量提高转速，发酵液的溶氧量也不会再增加。
f)粘度曲线本次实验统一使用S4转子进行粘度的测量，可以看出前8个小时并未测出发酵液的粘度，但从测得的胶干重来看，此时应该会有一定的粘度，可能由于转子测量范围有限，因此并未测出一定的数值。
可以看出在30h左右粘度开始迅速增加，此时菌体数量已达到一个比较稳定数值，开始大量产生黄原胶，所以随着产胶量的不断增加，发酵液的粘度在不断变大。
在后期随着营养物质消耗殆尽以及代谢产物不断增多，菌体数量也会逐渐减少，因此产胶能力也下降，所以虽然粘度仍不断增加，但其增长速率已经大大下降，最后会达到一个峰值。
g)pH曲线从最上方汇总的发酵曲线中可以看出，随着发酵过程的进行，发酵液的pH 有下降的趋势。
在生产阶段，一般发酵液的pH趋于稳定，稳定在最适合产物生成的pH范围。
2.2 菌体比生长速率2.3 产物比生成速率2.4 底物比消耗速率3、实验总结通过本次实验，我系统学习了微生物发酵的全过程，包括发酵过程中各个环节的基础理论，如菌种培养及种子的扩大培养、发酵过程控制、发酵动力学等。
了解了发酵设备的种类及结构。
学习实验室阶段发酵方法及如何进行工艺放大。
由于我们组做这个实验总共做了两遍，因此对发酵罐已经比较了解。
整体来说两次实验都比较顺利。
但最后测量菌体干重时可能由于操作不规范（我认为是我们在调节pH时没有很好的把握好应该加多少酸碱量，所以每个管加的量都不大一样）以及本次实验固有的误差的影响，菌干重的测量数据不够好。
在写实验报告的过程中我感觉我确确实实学到了很多，通过与老师和同学的沟通交流中，我现在已经比较熟练的用Origin作图，这是我最大的收获。
4、致谢附件：发酵实验原始数据黄原胶发酵实验数据记录表发酵时间（h）粘度（cP）胶干重（g/l）葡萄糖（g/l）发酵OD62菌体干重g/l）温度℃溶氧（%）转速（rpm）通风量vvmpH0 0 3.66 26 1.12 0.66 35.2 40.8 150 1.6 6.7 4 0 3.00 25.5 3.9 0.36 34.7 20.0 250 1.75 6.7 8 0 4.17 23.5 8.07 2.78 34.6 37.2 350 1.7 6.7 12 8.7 5.83 17 11.34 5.06 35.1 11.5 350 2.15 6.7 16 169 7.91 14 11.88 6.95 34.7 -14.4 400 2.2 6.5 20 486 8.66 12 11 8.23 35.0 -17.7 400 2.3 6.5 24 360 8.96 10 17.78 10.85 35.1 -17.4 400 2.0 6.5 29.5 930 9.47 8 21 13.24 35.4 -17.6 400 2.4 6.3 38.5 2700 10.03 7 16.65 43.67 35.6 -17.3 400 2.4 6.3 42.5 3570 10.11 6 15.8 58.81 35.4 -17.6 400 2.1 6.3 47.5 3990 11.12 5.5 20.15 58.9 35.8 -17.5 400 2.1 6.1 53.5 4020 11.3 4.5 15.25 65.87 36.3 -17.6 400 2.4 6.1 63.5 4440 11.93 4 16.85 61.35 36.4 -17.6 400 2.1 6.0 70 6150 12.40 3 17.6 63.4 36.2 -18 400 2.45 6.0。