细胞培养实验指导陈轶霞刘俊林实验报告书写要求：1、学生实验后应按时完成并提交实验报告。
报告要求结构完整、内容充实、图表齐全、书面整洁、分析讨论认真合理等。
2、严禁互相抄袭实验报告，发现雷同实验报告一律视为不及格。
3、切忌全班同学统一打印相同的实验结果图（以前曾发生过全班同学共用一张错误的图的情况）实验一细胞培养实验室介绍及使用卫生要求【目的与要求】1.了解细胞培养实验室的基本设施和布局2. 掌握细胞培养实验室的使用卫生要求【基本原理】细胞培养必须无菌操作，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素影响，应建立专门的实验室并划分不同功能区。
理想的细胞培养实验室可分为准备室、更衣室、缓冲室、培养室等。
【内容与方法】1．通过教师讲解并参观了解开展本课程教学的细胞培养实验室的布局、设施与仪器设备的摆放情况2.使用卫生要求。
（1）实验室的消毒实验室日常采用紫外灯消毒；按实验室的卫生管理要求对实验室洁净区按周期进行熏蒸消毒；在培养期间发生严重污染时要进行熏蒸消毒。
（2）培养工作开始操作前将所有培养用的物品经专用物流通道通过传递窗放进培养室，开紫外灯消毒30min，关紫外灯后方进入操作。
配有空气净化系统的洁净室在风机开启至少30min后才能达到相应的洁净度级别。
（3）操作者进入培养室时要遵守的程序a: 用肥皂洗手，在干手器上吹掉手臂上的水滴。
b: 换穿无菌室专用鞋，进入更衣室，外衣挂到指定的衣柜里，用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂进行消毒，戴帽子（不露头发）、口罩（应包住胡须），穿已消毒的洁净服，进入缓冲室。
再用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂消毒，在其滞留3min后进入培养室。
（4）开超净工作台10min，期间用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭操作台面后可开始具体的操作，同时点燃酒精灯用于临时性的火焰消毒。
（5）实验完毕，关闭超净工作台，及时清理实验用品，废物从通往物流通道的传递窗中传出。
工作台面用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭消毒后方可出培养室。
（6）出培养室时，将工作服放在更衣室指定的位置以便清洗和消毒，鞋放到隔离鞋柜里，跨过隔离鞋柜，将用过的一次性帽子、口罩、鞋套等放到指定的废物桶，出实验室前用肥皂洗手，关闭空气净化系统，开紫外灯30min。
注：(不写实验报告)实验二细胞培养的设备与器材【目的与要求】1.了解细胞培养常用设备与器材；2.掌握常用设备的基本操作程序及使用注意事项【内容与方法】1．通过教师讲解了解细胞培养常用设备的种类、使用注意事项以及常用器材。
2．通过教师讲解和演示，学生进行操作练习。
常用设备：C02培养箱、电热干燥箱、冰箱、倒置显微镜、超净工作台、过滤除菌装置、纯化水装置、细胞冷冻贮存器、离心机、天平、移液器、血球计数板、高压蒸汽消毒装置等。
常用器材：玻璃器皿：培养瓶、培养皿、离心管、注射器、储液瓶、吸管、载玻片、盖玻片、漏斗、烧杯、量筒等。
塑料品：冷冻管、多孔培养板、离心管等。
器械：解剖刀、眼科剪和镊、中号圆头镊、止血钳等。
橡胶制品：各种规格胶塞。
杂用品：金属饭盒、试管架、记号笔、搪瓷盘、吸头、酒精灯、酒精、碘酒棉球瓶和火柴等。
吸管筒等。
注：（不写实验报告）准备实验要求：整理常用器械并置于瓷盘内，以便演示讲解。
实验三实验器材的清洗、包装和灭菌【目的与要求】掌握细胞培养常用实验器材的清洗、包装、灭菌方法以及注意事项。
【实验原理】离体条件下，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。
因此，细胞培养器材清洗的要求要比普通实验的严格的多，应按不同器材的清洗、包装和消毒程序分别、分类处理。
【器材与试剂】剪刀、棉绳、棉花、牛皮纸、记号笔、饭盒、吸管筒、烧杯、清洁液、三蒸水等。
【内容与方法】1.各实验组准备后续实验所用的器材，如吸管、注射器、培养皿、青霉素瓶、盐水瓶、培养瓶、瓶塞、眼科剪及镊子等。
2.清洗步骤浸泡于水中的使用过的玻璃器材、胶塞煮沸，加入适量洗涤剂继续煮10min→刷洗→流水振荡冲洗→沥水→清洁液浸泡24小时→流水振荡冲洗15～20遍→沥水→蒸馏水冲洗3次→50℃烤干，待包装。
3．包装清洗后的培养瓶、培养皿、注射器、金属器械等器材用牛皮纸进行严密包装，封闭器材使用端，标记器材手持端，以便于消毒和贮存。
吸管的手持端加棉塞后单独包装或放入吸管筒；瓶盖、胶塞包装（5-10个/包）或放入铝饭盒。
4．消毒湿热灭菌：将包装好的物品放入压力蒸汽灭菌器内，15磅，20min。
干热消毒：主要用于玻璃器皿消毒，160℃维持90～120min。
注：（不写实验报告）准备实验要求：1、将清洗场所摆置整齐，比如清洗用洗盆、凳子、毛刷摆放整齐；2、放置3桶纯净水，并做好顺序标记以方便学生完成冲洗流程；3、配置好清洁液，并事先放入适量玻璃器皿以备教学之用；4、安排好烘干烤箱，并分别张贴好：“自来水冲洗烘干烤箱”和“纯净水冲洗烘干烤箱”；5、准备好包装所用的用品及器械，供教学时演示。
实验四细胞培养用液的配制【目的与要求】1. 掌握完全培养液、Hank’s液等常用细胞培养用液的配置及过滤除菌方法。
2. 培养无菌意识和无菌操作。
【实验原理】细胞培养离不开细胞在体外生存和生长的各种溶液，即培养用液。
培养用液主要包括培养液、平衡盐溶液、血清以及消化液、pH调整液和抗生素液等。
配置容器要严格清洗、消毒。
要明确标注所配液体名称及配制日期。
制备好的培养用液要及时消毒除菌并分装, 在适当的条件下贮存。
【器材与试剂】过滤器、试剂瓶、烧杯、容量瓶、吸管、移液器、KCl、KH2PO4、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4.7H2O、酚红、DMEM、血清、双抗、5.6%的NaHC03 溶液、三蒸水等【内容与方法】1. 各组配制500mL D-Hanks液（1）用数滴5.6%的NaHC03 溶液溶解0.01g酚红；（2）称取0.2g KCl、0.03g KH2PO4、4g NaCl、0.175g NaHCO3、0.03gNa2HPO4.7H2O依次溶解于适量三蒸水中( 注意应待前一种试剂完全溶解后，再溶解下一种成分)。
（3）将（1）加入（2）中；（4）将（3）移入容量瓶中，定容至500mL；（5）分装，10磅20分钟高压蒸气灭菌，4℃冰箱内保存。
2. 各组练习配制30mL完全培养液，培养无菌操作意识。
在超净台内按照无菌操作要求取27mL DMEM液，加入3 mL血清、300μL双抗，练习过滤除菌方法。
注：（不写实验报告）准备实验要求：在超净台内放置好做好标记的DMEM液、血清、双抗（3种都可用替代品）、用过的过滤器（平时注意收集）、吸管、洗耳球、烧杯及培养瓶等。
实验五培养细胞的观察【目的与要求】掌握倒置显微镜观察贴壁型细胞的方法。
【实验原理】细胞在体外培养过程中需要每天观察，以便及时了解细胞的生长状态。
活细胞对光线是透明的，光线通过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变，所以用普通光学显微镜无法看清未经染色的活细胞。
倒置显微镜利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光波的光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比，从而使标本的各种结构变得清晰。
因此，体外培养细胞的观察必须要用倒置显微镜。
【器材与试剂】倒置显微镜、生长良好的细胞。
【内容与方法】在倒置相差显微镜下对培养细胞的生长状况进行观察。
注：（本实验不写实验报告）准备实验要求：准备几瓶细胞供学生练习观察实验六细胞计数及活力检查【目的与要求】掌握细胞计数及活力检查的原理和方法。
【基本原理】培养的细胞接种合适的密度才能生长良好，细胞计数是调整细胞密度的依据。
细胞活力测定是了解细胞状态的重要手段。
用台盼蓝染细胞时，由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，染料可大量进入不能排出被染成蓝色；活细胞能排出染料，不易着色。
【器材与试剂】移液器、血球计数板、盖玻片、吸管、吸耳球、dorf管、离心管、SP2/0-Ag14悬浮细胞、0.4%台盼蓝液等。
【内容与方法】1. 细胞计数——计数板计数法(1)将血球计数板及盖片擦试干净，并将盖片盖在计数板的2个小室上。
(2)加样：细胞悬液吹匀后，用200μl加样枪吸出滴加在盖片边缘与计数板交界处，使细胞悬液进入小室，并充满盖玻片和计数板的间隙。
(3)用10×物镜镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞计左侧和上方者。
按下式计算：细胞数/mL＝4大格细胞总数/4×104注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
2. 染色法检查细胞活力(1) 分别滴一滴细胞悬液和0.4%台盼兰染液于载玻片上，用盖玻片角混匀。
(2) 45度盖上盖玻片，计数200个细胞。
(3) 计算细胞活力。
细胞活力（%）= 活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%（完成实验报告）准备实验要求：将本实验用器材、液体、待计数的细胞做好标记放置于普通光学显微镜旁边，以方便学生操作。
实验七细胞生长曲线的绘制【目的与要求】掌握细胞生长曲线绘制的方法.【实验原理】细胞生长曲线是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标,它以培养时间(d)为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。
【器材与试剂】吸管、吸耳球、血球计数板、微量加样器、96孔培养板、SP2/0-Ag14细胞悬液等。
【内容与方法】1. 在超净台中，将浓度为1.0×104个/mL SP2/0-Ag14细胞悬液，用微量加样器接种96孔细胞培养板，每孔200µL，接种24孔，置CO2培养箱培养。
2．从培养第24h开始，每24h分别于超级工作台上吸出3孔的细胞进行计数，计算其平均值。
（注意，每天取计数细胞时将待取培养孔中的细胞吹打几下，确保沉于孔底的细胞全部吸出，此过程要保证无菌操作，以免污染细胞，导致细胞死亡，实验失败）3．以细胞浓度为纵坐标、细胞生长时间为横坐标绘制生长曲线。
注意：每2组或3组用一块培养板。
（完成实验报告）准备实验要求：将接种细胞事先计数浓度，然后预先稀释成1.0×104个/mL的细胞悬液，吹吸混匀后为各小组分装一份，做好标记放置于超净工作台内。
实验八细胞融合【目的与要求】掌握聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合的操作方法。
【实验原理】两个或两个以上的同种或不同种细胞在诱导物的作用下，细胞膜发生一定变化，融合成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合。
聚乙二醇（PEG）是常用的化学诱导剂，它可促使细胞凝结，并破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，使细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个双核或多核融合细胞。
【器材与试剂】移液器、吸管、离心管、载玻片、盖玻片、50%PEG、次甲基蓝染液、Hanks液、SP2/0-Ag14细胞、DMEM完全培养液等。