实验2 茶叶中咖啡因的微波提取工艺一、实验目的1.明确微波提取法提取原理；2.学会用微波提取法提取茶叶中的咖啡因；3.使用分光光度计，建立标准曲线，检测茶叶中咖啡因的含量。
二、实验原理咖啡因是杂环化合物嘌呤的衍生物，它的化学名称为：1,3,7－三甲基－2,6－二氧嘌呤，其结构式如下：NNHN NN NNOOCH3CH3H3C嘌呤咖啡因含结晶水的咖啡因系无色针状结晶，味苦，能溶于水、乙醇、氯仿等。
在100℃时即失去结晶水，并开始升华，120℃时升华相当显著，至178℃时升华很快。
无水咖啡因的熔点为234.5℃。
从茶叶中提取咖啡因传统的方法有乙醇回流法和碳酸钠溶液煮沸法。
但前者需在Soxhlet萃取器中回流约2.5h 以上, 周期较长、醇耗、能耗较大, 不利于工业化生产。
后者虽只需煮沸20m in, 但煮沸后呈泥胶状, 过滤和萃取均很难, 致使收率很低。
微波是频率介于300 MHz和300 GHz之间的电磁波。
微波提取的原理是微射线辐射于溶剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于溶剂及细胞液吸收微波能，细胞内部温度升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的有效成分从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。
微波具有穿透力强、选择性高、加热效率高等特点.微波作用于植物细胞壁，其热效应促使细胞壁破裂和细胞膜中的酶失去活性，细胞中多糖容易突破细胞壁和细胞膜而被提取出来，大大加快了反应提取速度、反应时间以分、秒计，有效地提高了多糖得率。
微波提取法是强化固液提取过程颇具发展潜力的一项新型辅助提取技术。
三、仪器与试剂仪器：微波萃取仪；紫外-可见分光光度计；分析天平（1台）；50 mL容量瓶（8个）；100 mL 容量瓶（1个）；1 mL 、2 mL 吸量管；50mL烧杯（10个）; 100mL（3个）; 布式漏斗；滤纸；抽滤瓶等。
试剂：无水乙醇；0.5 mg/mL咖啡因标准溶液等。
四、实验步骤：（一）、制作标准曲线从无水乙醇为溶剂的咖啡因储备液( c = 500. 0μg/ mL) 中移取0. 50 ，1. 00 ，1. 50 ，2. 00 ，2. 50 ，3. 00 ，3. 50 mL于7 个50 mL 容量瓶中用50%的乙醇定容，得到浓度为5. 00 ，10. 00 ，15. 00 ，20. 00 ，25. 00 ，30. 00 ，35. 00μg/ mL 的系列标准溶液。
在紫外分光光度计上测其最大吸收波长处的吸光度A ，得标准曲线。
（二）、咖啡因的提取1.提取工艺流程原料→粉碎→加入溶剂→微波处理→过滤→离心→粗提液→测定吸光度值2．提取工艺条件优化(1)．单因素实验I．微波功率的筛选微波功率的筛选称取5 g茶叶, 加入80 mL 50 %乙醇, 配制5 份相同混合液, 将混合液放置于微波提取仪中, 设定温度为90 ℃的条件, 改变功率（300 W、400 W、500 W）微波10 min, 测定不同微波功率下提取液的吸光度值A. II．微波时间的筛选称取5 g 茶叶, 加入80mL50 %乙醇, 配制5 份相同混合液，将混合液放置于微波提取仪中, 在设定温度为90 ℃，微波功率为500 W的条件下，微波加热不同的时间(13 min、14 min、15 min) ，测定不同微波时间条件下提取液的吸光度A.III．微波温度的筛选称取5 g茶叶，加入80 mL 50 %乙醇，配制6 份相同混合液，将混合液放置于微波提取仪中，设定微波时间为14 min，功率为500 W，改变微波设定温度（160 ℃、180 ℃、200 ℃) 测定不同微波温度下提取液的吸光度值A。
IV. 料液比的选择称取3 份5 g 茶叶, 分别按料液比1∶7，1∶8，1∶9加入50 %乙醇, 设定微波时间为14 min, 功率为500W, 微波温度为180 ℃的条件下进行微波处理，测定不同料液比下提取液的吸光度值A.(2). 正交试验序号时间/min 功率/w 温度/o C 料液比吸光度1 2 3 4 5 6 7 8 9 1212121414141616163004005004005003005003004001601802001802001602001601801:71:81:91:91:71:81:81:91:7（三）、提取率的比较与结论五、注意事项：1.微波萃取仪的正确操作。
2.分光光度计的工作原理及操作注意事项。
六、问题与讨论：1.本实验中，影响提取率的因素有哪些？根据自己所了解的知识思考各因素是如何影响提取率的。
2.咖啡因有哪些生理作用？备注：由于影响提取率的因素较多，同学们可以合作完成。
*******知识链接：茶叶是人类最佳的天然保健饮料,茶叶中含有机化合物450多种、无机矿物质15种以上及人体必需的营养成分和药用成分. 茶对血管硬化、高血压、动脉粥样硬化、放射损伤、肿瘤、免疫功能降低的防治都有功效. 寓养生、保健、防癌功能于品茗之中,这是其它饮料所无法取代的.一、常用提取方法简介：（一）热水提取法热水提取法即传统的水煮法，是提取中草药有效成分常用的传统方法之一，有不需特殊设备、成本低等自身的优点，但此法往往提取效率低且费时。
（二）纤维素酶辅助提取法酶技术是近年来用于植物有效成分提取的生物工程技术，在提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速有效成分的释放和提取。
常用的酶有蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等。
选用恰当的酶可以比较温和地将植物组织分解，加速有效成分的释放，从而提高其提取率。
（三）超声辅助提取法超声提取是利用超声波的空化作用及各种次级效应来达到促进植物有效成分溶出的目的，无需加热，但体系应保持一定温度。
超声波提取法使样品介质内各点受到的作用一致，降低目标物与样品基体的结合力，加速目标物从固相进入溶剂的过程，克服了常规提取方法的不足，实现了低温常压环境下对固体样品进行快速、高效、可靠的预处理，是近年来应用到中草药有效成分提取分离的一种新手段。
现普遍认为其空化效应、热效应和机械作用是超声波技术在中药提取中的三大理论依据。
超声波提取的原理是利用超声波增大物质分子运动频率和速度，增强溶剂穿透力，提高药物溶出速度和溶出次数，缩短提取时间。
另外超声波的级次效应也在分离中起到重要作用，如机械震动乳化、扩散、击碎、化学效应等，也能加速提取成分的扩散和释放并与溶剂充分混合而利于提取。
因此，中药材的有效成分在超声波场的作用下不但作为介质质点获得自身巨大的速度和动能，而且通过超声波的空化效应获得强大的外力冲击，加上超声波的多级效应，所以能高效率并充分地提取中药的有效成分。
但是关于超声波提取的功率、时间以及提取温度等条件需作进一步的探索。
（四）酶-超声联合提取法酶-超声联合提取法即植物在最佳酶解条件下反应后，再进行超声提取。
这种联合提取方法集酶辅助提取和超声提取两种方法的特点于一身，更具有研究价值。
（五）、微波辅助提取法微波是频率介于300 MHz和300 GHz之间的电磁波。
微波提取的原理是微射线辐射于溶剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于溶剂及细胞液吸收微波能，细胞内部温度升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的有效成分从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。
微波具有穿透力强、选择性高、加热效率高等特点.微波作用于植物细胞壁，其热效应促使细胞壁破裂和细胞膜中的酶失去活性，细胞中多糖容易突破细胞壁和细胞膜而被提取出来，大大加快了反应提取速度、反应时间以分、秒计，有效地提高了多糖得率。
微波提取法是强化固液提取过程颇具发展潜力的一项新型辅助提取技术。
（六）、超临界二氧化碳萃取法超临界二氧化碳( SFE- CO2) 萃取分离主要是利用在CO2的超临界温度和临界压强下, CO2所呈现出的扩散系数比液体大得多、黏度与气体相似的双重特性, 在高压、低温下将有效成分溶解出, 而后在降低压强或升高温度的条件下, 利用有效成分溶解度降低而实现有效分离。
用超临界二氧化碳萃取技术进行中草药有效成分的提取和传统的中药提取方法相比具有独特的优点: 萃取能力强, 提取率高; 萃取温度低, 能较好地保存中药有效成分不被破坏、不发生次生化, 尤其适合热敏感性强、易氧化分解破坏的成分的提取; 生产周期短、环保; 具有抗氧化、灭菌等作用, 有利于保证和提高产品质量等。
所以要提高中药产品的质量、实现中药产业的现代化、更好地提高中药产品的附加值、增强我国中药产品在国际市场上的竞争力, 超临界萃取技术的推广和使用起着举足轻重的作用。
二、正交试验法简介正交试验法与黄金分割法一样，是为了提高试验效率而又不丢失重要数据的一种优选试验方法。
正交试验既能够大幅度减少试验次数而又不会降低试验可信度。
这种方法有一系列可供选用的正交试验表，这些表是数学家根据各种可能的因素和水平设计好的，只需找到对应自己需要的就可以。
这种正交试验表，也就是一套经过周密计算得出的现成的试验方案，他告诉你每次试验时，用哪几个水平互相匹配进行试验，这套方案的总试验次数是远小于每种情况都考虑到的全因子法的试验次数的。
比如3水平4因素表就只有9行，远小于全部试验的81次；我们同理可推算出如果因素水平越多，试验的精简程度会越高。
建立好试验表后，根据表格做试验，然后就是数据处理了。
由于试验次数大大减少，使得试验数据处理非常重要。
首先可以从所有的试验数据中找到最优的一个数据，当然，这个数据肯定不是最佳匹配数据，但是肯定是最接近最佳的。
这是你能得到一组因素，也是最直观的一组最佳因素。
接下来将各个因素当中同水平的试验值加和(注：正交表的一个特点就是每个水平在整个试验中出现的次数是相同的)，就得到了各个水平的试验结果表，从这个表当中又可以得到一组最优的因素，通过比较前一个因素，可以获得因素变化的趋势，指导更进一步的试验。
各个因素中不同水平试验值之间也可以进行极差、方差等计算，可以获知这个因素的敏感度等，然后再根据统计数据，确定下一步的试验，目的就是确定最终的最优值。
当然，如果因素水平很多，这种寻优过程可能不止一次。