芳环上 取代基 吸电子基团 减弱甚至会猝灭荧光
如-COOH、-NO、-C O、卤素
卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低
在重原子中，能级之间的交叉现象比 较严重，因此容易发 生自旋轨道的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的速 20 率
3. 金属螯合物的荧光 大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能 发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。 不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由 于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光。 但是，若这些化合物和金属离子形成螯 合物，随着分子的刚性增强，平面结构的 增大，常会发生荧光
32
磷光分析仪器
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。 在有荧光发射的同时测量磷光
应用
33
化学发光分析法
一、基本原理
A +B
→C
+ D*
D* → D + h
某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时， 发射出一定波长的光
（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物 （2）发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170～300 kJ/mol；位于可见光区 （3）发光持续时间较长，反应持续进行 发光反应如果存在于生物体(萤火虫)中，称生物发光
其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态
T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。 V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。
5
非辐射能量传递过程；
S1
S2
T1
振动弛豫:
在同一电子能级 中，电子由高振 动能级转至低振 动能级，而将多 余的能量以热 的 形式发出。发生
整理得：
If =2.3 I0 kbc 当入射光强度I0 和b一定时，上式为： If = K c 即荧光强度与荧光物质的浓度成之正比， 但这种线性关系只有在极稀的溶液中， 当 kbc0.05时才成立。 对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸 收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性 关系。
25
2 、影响荧光强度的环境因素
NO + O3 → NO2*
NO2* → NO2 + h
37
（2）液相化学发光
化学发光反应在液相中进行
应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；
荧光是由激发单重态最低振动能层至基态
区别
磷光是由激发三重态最低振动能层至基态
11
(二 )荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱:(ex) 以不同波长的入射光激发荧光物质,在荧 光最强的波长处测量荧光强度 即以激发光波长为横坐标,以荧光强度为 纵坐标绘制曲线即可得到激发光谱曲线。
发射光谱：(em)
固定激发光波长（最大） 然后测定不同的波长时所发射的荧光强度 即可绘制荧光发射光谱曲线
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级 →基态， T1 → S0跃迁；
电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） 增加试样的刚性: 固体磷光法： 分子缔合物的形成： 重原子效应： 敏化磷光： 低温冷冻 吸附于固相载体（滤纸） 加入表面活性剂等 加入含重原子的物质，如银盐等 通过能量转移产生磷光
定义：荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子 的相互作用引起荧光强度降低的现象
激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞 碰撞猝灭荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态
静态猝灭
荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光
的络合物
溶解氧与荧光物质
类型 转入三重态的猝灭
发生电子转移反应的猝灭
猝灭剂与荧光物质
荧光物质的自猝灭
12
在荧光的产生过程中，由于存在各种形 式的无辐射跃迁，损失能量，所以它们的 最大发射波长都向长波方向移动，以磷光 波长的移动最多，而且它的强度也相对较 弱。
13
14
激发光谱与发射光谱的关系
a. Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比
激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
8
S0 吸光1 吸光2 荧光3
辐射能量传递过程 荧光发射: 电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态 得到最大波长为λ 3的荧光 由图可见，发射荧光的能量
S1 S2 T1
比>λ
1
S0 吸光1 吸光2 荧光3
荧光
9
磷光发射:
电子由基态单重态激发至第一 激发三重态的几率很小，因为这 是禁阻跃迁。 但是，由第一激发单重态的最 低振动能级，有可能以系间窜跃 方式转至第一激发三重态，再经 过振动驰豫，转至其最低振动能 S0 级，由此激发态跃回至基态时， 便发射磷光，
原子吸收光谱 原子光谱 原子发射光谱 原子荧光 光谱分析法 分子吸收 分子光谱 分子发光 红外光谱 紫外可见光谱
第二章 分子发光分析
分子
吸收能量
激发为激发态
释放出能量
基态
辐射跃迁 电能 化学能 光能
光的形式释放
非辐射跃迁
以热的形式释放
称为“发光” 光致发光 分子发光 荧光 磷光
2
化学发光
分子荧光分析法 一、基本原理 （一）荧光和磷光的产生 从分子结构理论来讨论
电子所处的能级
振动能级 转动能级
分子中电子 的能量状态
电子的多重态
S=0, J=1 单重态S表示
（所有电子都是自旋配对的）
J=2S+1
S：为各电子自旋量子 数的代数和
大多数基态分子都处于单重态
S=1, J=3
三重态 T表示 电子在跃迁过程中伴随着
3 自旋方向的变化（自旋平行）
基态单重态S
激发态单重态S
浓度较高单重激发态的分子在发生荧光之前和未 激发的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭 28
二、荧光分析仪
光源
氙灯和高压汞灯
激发单色器 扫描激发光谱，选择激发波长 I0
光电倍增管
光栅
样品池
发射单色器
检测器
显示器
If
I
扫描发射光谱 消除其它光线的干扰 获得所需的荧光
两个单色器 与分光光度计的差别
两个单色器互成直角
dc/dt是分析物参加反应的速率
35
若化学发光反应是一级动力学反应则
dc A I cl t dt cl dt cl c 0 0 dt
t t
即发光总强度与被测物浓度成线性： 二、化学发光反应类型
1. 直接化学发光和间接化学发光 直接发光 是被测物作为反应物直接参加化学发光反应 ，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子 A + B C* + D C* C + h
2. 荧光与有机化合物结构的关系 （1）跃迁类型 实验证明，对于大多数荧光物质，首先经历 激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射 跃迁，再发生 跃迁而得到荧光。 （2）共轭效应 实验证明，容易实现激发 的芳香族化合物 容易发生荧光，增加体系的共轭度荧光效率一般 也将增大，主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光 系数，有利于产生更多的激发态分子
被测物本身有荧光
直接荧光法
被测物与试剂反应后
被测物使荧光熄灭
F与物质的 浓度成正比
方法
荧光猝灭法
由荧光强度降低的强度来测定被 测物的含量 某些阴离子夺取金属络合物中金属 离子，而释放出能发荧光的配位体
间接荧光法
催化荧光法
反应速度慢，荧光微弱，难测定 31 金属离子将加速反应进行
磷光分析法
1．如何获得较强的磷光
16
1.荧光效率 它表示物质发射荧光的能力，通常用下 式表示 发荧光的分子数 f 激发分子的总数

荧光效率越高；物质发射荧光越强

f

Kf Kf
kf为荧光发射过程的速率常数（与化学结构有关） ki为其它有关过程的速率常数的总和（化学环境）
Ki
凡使kf 值升高而使ki值降低的因素，都可增强荧光。 17
b. 发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级 图
2
, 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的
最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光
c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一 样）成镜像对称关系。
15
（三）荧光的影响因素 分子产生荧光必须具备两个条件： ① 分子必须具有与所照射的辐射频 率(紫外-可见光）相适应的结构 （共轭双键），才能吸收激发光； ② 吸收了与其本身特征频率相同的 能量之后，必须具有一定的荧光量 子产率。
21
22
4．溶剂效应
同一种荧光物质溶于不同溶剂，其荧光光谱的位置和强度 可能有明显不同。
一般情况下，随着溶剂的极性的增加，荧光物质的π→π*
跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移。
5 ．温度的影响
一般说来，大多数荧光物质的溶液随着温度的降低， 荧光效率和荧光强度将增加 如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10 ℃， 荧光效率增加3%，冷至-80℃时，荧光效率为100%。
激发态三重态T
激发单重态S与激发三重态T的不同点：
⑴ S是抗磁分子，T是顺磁分子
⑵ tS = 10-8s, tT = 10-4～1s；(发光速度很慢)
⑶ 基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，
基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁；
⑷ 激发三重态的能量较激发单重态的能量低
4
2．分子内的光物理过程
29
三、分子荧光分析法及其应用
1. 荧光分析方法的特点
（1）灵敏度高
（2）选择性强
（3）试样量少和方法简单 （4）提供比较多的物理参数 2、荧光定量分析的方法 标准曲线法 荧光强度与荧光物质浓度成正比的关系 比较法 同样条件下，测定试样溶液和一标准溶液