哈尔滨商业大学食品工程学院生物工程专业一班xx论啤酒生产中应用酶加工技术的途径与可行性的工艺方法论啤酒生产中应用酶加工技术的途径与可行性的工艺方法一、引言啤酒生产历史悠久, 大约起源于9000 年前的中东和古埃及地区. 本世纪初啤酒从欧洲传入中国. 新中国成立以后, 我国啤酒工业发展很快, 几十年内年产量便从10 kt 迅速增长到18000 多kt , 跃居为世界第二大啤酒生产国. 但我国人口众多, 人均年啤酒消费水平仅为13 L, 远远低于发达国家. 这说明了我国啤酒工业发展的潜力还很大. 随着各厂家的逐渐扩大和消费者对产品质量要求的提高, 市场的竞争必然日趋激烈. 在这种形势下, 如何降低生产成本、缩短生产周期和提高啤酒质量对于各生产厂家来说, 就变得越来越重要. 同时, 啤酒生产上的一些因素, 如麦芽的质量、麦汁的黏度和发酵度等, 在不同程度上影响着啤酒的质量.二、啤酒生产中常用的应用酶1、淀粉酶淀粉酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶, 啤酒生产中主要应用α-淀粉酶和β-淀粉酶. 淀粉水解酶的主要作用是催化淀粉的水解, 将大分子淀粉分解为小分子的糊精、低聚糖和葡萄糖. 前者残存在啤酒中及一起着丰富酒体, 提高醇厚口感的作用; 后者可被酵母所利用生成酒精, CO2系列代谢副产物.1.1α-淀粉酶、β-淀粉酶只可作用于淀粉分子内任意α-1, 4 键, 且从分子链的内部进行, 故又称内淀粉酶, 属于内切酶. 在水溶液中α-淀粉酶能使淀粉分子迅速液化, 产生较小分子的糊精, 故也被称为液化酶.α-淀粉酶作用于直链淀粉, 分解产物为6～7 个葡萄糖单位的短链糊精及少量的麦芽糖和葡萄糖, 糊精还可以进一步水解. 按理论最终产物为87%的α-麦芽糖和13%的葡萄糖.α-淀粉酶作用于支链淀粉只能任意水解α-1, 4 键, 但不能分解α-1, 6 键也不能绕过α-1, 6 键. 作用接近α-1, 6 键时速度放慢, 其分解产物为-α界限糊精、麦芽糖和葡萄糖.常用的α-淀粉酶有耐高温α-淀粉酶, 真菌α-淀粉酶.啤酒生产中常用的耐高温α-淀粉酶一般由地衣芽孢杆菌产生, pH 在5. 0～7. 0 内较稳定, 尤以pH= 6. 0 为佳, 作用淀粉的最适温度为90℃[ 1]. 国际上, 由丹麦NOVO 公司提供的真菌-淀粉酶应用最广, 它由米曲霉菌产生, 最适pH 为5. 6～5. 8, 最适温度为60 ℃～65 ℃. 除了上述两种酶外, 中温α-淀粉酶也开始应用到啤酒生产中. 单独使用耐高温-淀粉酶比单独使用中温α-淀粉酶麦芽糊精收率高, 透光率也较大, 但黏度较高, 将两者结合起来使用, 则可互相弥补不足, 得到很好的效果[ 2] .1. 2 β-淀粉酶β-淀粉酶是一种含- SH 基的外切酶, 作用于淀粉分子的非还原性末端, 依次地水解1 分子麦芽糖, 故作用速度缓慢.β -淀粉酶也只能作用于β-1, 4 键, 遇β-1, 6 键即停止水解, 它作用于直链淀粉产生β-麦芽糖, 作用于支链淀粉, 除了产生麦芽糖外, 还有界限糊精. 因为β-淀粉酶作用速度较慢, 所以需要与β-淀粉酶协同作用. 如果没有β-淀粉酶快速地产生大量糊精, 提供多量非还原性末端基, β-淀粉酶就难于实现快速糖化. 目前, 国内研制的β-淀粉酶主要有芽孢杆菌β-淀粉酶, 多黏芽孢杆菌β-淀粉酶及甘薯β-淀粉酶.1. 3 支链淀粉酶支链淀粉酶又名R-酶、界限糊精酶或解支酶, 它可水解聚麦芽三糖和来自支链淀粉及糖原的界限糊精的内部β-1, 6 键. 来自微生物的与来自植物的支链淀粉酶很类似, 但它们的活性有区别, 前者能分解糖原, 而后者不能. 几十年来, 各国的科研人员已经开发出不少种解枝酶, 主要有R-酶( 来源于植物) 和普鲁兰酶( Pulluluanaese, 来源于微生物) , 它们主要应用在干啤酒生产中[ 3] . 美国威斯康星州Miller 酿造公司从大米中提取出了解支酶, 并成功地应用于生产低热量啤酒[ 4] .2 蛋白酶蛋白酶是分解蛋白质肽键一类酶的总称, 可分为内肽酶和端肽酶两类. 内肽酶能切断蛋白质分子内部肽键, 分解产物为小分子的多肽. 端肽酶又分为羧肽酶和氨肽酶两种. 此外还有一种二肽酶, 它分解二肽为氨基酸. 羧肽酶是从游离羧基端切断肽键, 而氨肽酶则从游离氨基端切断肽键. 通常说的蛋白酶多是指内肽酶,而羧肽酶、氨肽酶和二肽酶总称为肽酶或端肽酶.啤酒生产中常用到的蛋白酶通常以来源来命名, 如胃蛋白酶( 动物蛋白酶) 、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶( 植物蛋白酶) 、细菌蛋白酶和霉菌蛋白酶( 微生物蛋白酶) 等. 我国广西地区盛产木瓜, 当地有一些生物公司( 如南宁华南生物公司) 从木瓜中提取木瓜蛋白酶, 该酶最适pH 为4～6, 最适温度为55 ℃～65 ℃[ 5, 6] . 在国外啤酒生产中, 植物来源的蛋白酶应用更普遍, 其中最常用的是木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶,其他植物蛋白酶如从磨菇和大麦中提取的蛋白酶应用普遍程度略低于前两种[ 7] .3α-乙酰乳酸脱羧酶(α -ALDC)α-乙酰乳酸脱羧酶可催化α-乙酰乳酸分解为2, 3-丁二醇. 双乙酰含量是影响啤酒风味的重要因素, 对啤酒质量具有决定性的影响, 是品评啤酒成熟与否的主要依据. 它的形成途径为: 糖类→丙酮酸→α-乙酰乳酸→双乙酰. 酰乳酸脱羧酶可调节双乙酰前体物质走支路代谢途径从而控制双乙酰的含量. 4 β-葡聚糖酶β-葡聚糖酶是催化降解β-葡聚糖的一类酶. 麦芽中形成的-β葡聚糖酶最适温度为40 ℃～45 ℃, 如达到60 ℃时不到2 min 酶活力就会损失50% , 影响β-葡聚糖的降解. 因此通常需要向糖化醪中添加β-葡聚糖酶( 特别是耐温的酶) , 以弥补低质麦芽的缺陷, 降低糖化醪的黏度.常用的β-葡聚糖酶主要包括: 内--β葡聚糖酶、外-β-葡聚糖酶及其复合酶试剂( 如β-葡聚糖酶混合酶、耐温β-葡聚糖酶复合酶等) . 它们的特性及作用见表1[ 1, 8] .丹麦NOVO 公司的研究人员从70 年代末就开始研制α-葡聚糖酶制剂, 他们从微生物中提取出了内-β-葡聚糖酶并制成酶制剂. 经过不断完善, 已成功应用于啤酒生产中, 有效地降低了麦汁黏度, 改善了麦汁过滤性能[9] .5 复合酶单一酶制剂在啤酒生产上应用时, 总会有一定的局限性. 而将单一酶制剂制成复合酶制剂则可弥补各个酶的缺点, 得到较好的效果. 如α-淀粉酶耐温不耐酸, 而β-淀粉酶不耐温, 两者结合起来使用则可起到互补协同作用. 国外商品化的复合酶制剂较多, 如丹麦NOVO 公司生产的Celluclast 复合酶[ 10] 及含α-淀粉酶和-葡聚糖酶的Brew-N-zymeGP 复合酶[11] , 美国Snyder 公司生产的含有β-淀粉酶、-葡聚糖酶和蛋白酶的β-葡聚糖混合酶等复合酶制剂. 我国也有一些公司和科研单位研制出了复合酶制剂, 如黑曲霉F27 固体曲( 含有α-葡聚糖酶,β -淀粉酶和液化酶) [1] , 安徽聚星公司的由芽孢杆菌得到的复合酶制剂( 含有β-葡聚糖酶, β-淀粉酶和蛋白酶) [12] .6 其他酶应用于啤酒工业的还有一些其他种类的酶, 如超氧化物岐化酶( SOD) 、葡萄糖氧化酶、磷酸脂酶等[ 8, 11].SOD 能对生物体内由各种途径产生的超氧自由基起到岐化作用, 从而解除自由基的毒性. 葡萄糖氧化酶可催化氧与葡萄糖生成葡萄糖酸内酯而消耗溶解氧, 因而常被用作抗氧化剂, 以防止啤酒氧化变质. 磷酸脂酶可以催化酸和醇生成酯, 提高啤酒中呈香呈味物质的含量.三、酶制剂在啤酒生产中的应用啤酒生产以麦芽为主要原料, 添加大米、大麦、玉米等未发芽谷物和酒花等辅料. 其生产流程为原料→粉碎→糊化→糖化→过滤→麦汁煮沸→酒花分离→沉清→冷却→前发酵→后发酵→过冷却→过滤→灌装.酶制剂在啤酒生产中主要应用在以下7 个方面.1 提高啤酒的辅料比例从大麦制成麦芽, 其费用约增加70%～100%, 因此麦芽的价格远远高于没有发芽的大麦、玉米、大米等谷物. 我国啤酒生产中均添加大米、玉米等辅料, 它们的价格低、来源广, 可大大降低生产成本. 但是由于未发芽谷类辅料所含酶数量较少, 当辅料的比例提高到30%以上时, 仅仅靠麦芽本身的酶是不够的. 因此在糖化时通常加入α-淀粉酶和β-淀粉酶, 即使辅料超过30% , 淀粉也可充分水解成麦芽糖和糊精. 这样, 虽然要增加辅料加工设备, 有热能消耗, 还需增加酶试剂的费用, 但总成本还是可以大大降低的.2 弥补低质量麦芽的缺陷我国啤酒专用大麦生产基地少, 大麦质量和产量并不高, 制得的麦芽的质量也不太好. 生产上多依赖于价格较贵的进口大麦, 从经济角度考虑是不可行的. 而在啤酒生产中采用酶制剂则可弥补麦芽质量的缺陷.使用质量较差的麦芽, 常常出现糖化不完全、过滤困难、麦汁组成不理想、原料收得率低等现象. 添加淀粉酶制剂, 可加速麦芽的糖化, 解决糖化不完全的问题. 添加蛋白酶制剂,可促进蛋白质分解, 提高麦汁β-氨基氮含量, 改善麦汁的合理组成. 添加α-葡聚糖酶制剂, 可使β-葡聚糖分解, 涤而降低糖化醪的黏度, 加快麦汁过滤速度, 缩短麦汁澄清时间, 提高麦汁收得率.3 提高啤酒的非生物稳定性啤酒在销售、贮存过程中所形成的浑浊主要是由于聚合的多酚物质与蛋白质缓慢结合引起的. 在发酵和贮酒期间, 添加蛋白酶制剂如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶, 可分解引起混浊的蛋白质, 使其不易与多酚物质缩合, 从而提高啤酒的非生物稳定性. 据报导[14] , 在啤酒旺季酒龄较短的情况下, 采用在糖化过程中每t 麦芽加36%的甲醛800 mL, 以及在啤酒过滤后加5×10- 5%的木瓜蛋白酶, 能够使啤酒稳定时间达到4 个月以上,而对啤酒的其他质量指标几乎没有不利影响. 4 增加啤酒品种, 生产高发酵度啤酒干啤酒是近几年比较流行的一种新品种, 其主要特色就是发酵度高, 一般在72% 以上, 而一般啤酒的发酵度只有60%左右. 干啤酒口味纯正淡爽, 色泽浅, 苦味轻, 残糖量和热值都很低, 比较符合大众消费口味.要获得如此高的发酵度, 必须将麦芽中残存的淀粉和糊精降解, 提高麦汁中可发酵性糖的含量. 由于大麦中有45% ～50%( 干物质) 的支链淀粉, 有较多的α-1, 6 键, 必须加解支酶才能有效地提高麦汁中可发酵性糖含量. 由于由细菌发酵得到的异淀粉酶和由根霉及黑曲霉产生的糖化酶的应用条件不太符合麦汁生产和干啤酒的酿造, 所以在麦汁生产和干啤酒的酿造过程中一般是添加普鲁兰酶. 该酶在糖化时加入量为1. 5 %( V / W) , 通过外加酶制剂协同糖化后可得到麦汁极限发酵度> 78% 的10°麦汁, 配合使用高发酵度的啤酒酵母, 可以酿造出优质干啤酒[ 3, 15] .5 防止啤酒风味老化啤酒的风味常常与那些含量极微而风味独特、性能又不太稳定的物质有关.啤酒的风味物质主要是高级醇、酯类、醛类、双乙酰酚类等酵母代谢副产物. 而影响啤酒风味的主要物质是含羧基、醛基、硫基化合物及烯醇等. 这些物质又极易氧化成糠醛、羟基甲基糠醛结合物质及部分较高级醛类, 这些都是啤酒不新鲜呈味物质的主要来源. 这些物质被氧化, 改变了它们原有的性质, 一些不呈味物质变成呈味物质, 改变了啤酒原有的醇厚和清香, 使酒花香味消失, 产生不愉快的苦涩、老化味及其他异味. 啤酒的氧化味( 老化味) 主要是由于贮酒时生成挥发性羰基化合物, 特别是氧化生成不饱和醛类, 如啤酒中 式-壬烯醛含量接近1×10- 7%时就会感到老化味. 高温杀菌时, 若瓶颈空气含氧量较高, 啤酒强烈氧化也会产生老化味. 啤酒中的一些物质如低分子氮、酒花树脂等经高温杀菌发生相互作用, 会因失去一个碳原子生成醛类物质, 氧化变味, 改变啤酒的典型性. 可以说氧是啤酒风味变坏的主要因素之一.为了防止氧化, 啤酒生产中常常加入葡萄糖氧化酶. 该酶是一种对氧非常专一的理想生物高效除氧剂,能迅速溶解瓶颈氧气. 它可以使氧与瓶颈中的葡萄糖生成葡萄糖酸内酯而消耗溶解氧, 这种葡萄糖内酯较稳定, 没有酸味, 对啤酒的质量没有什么影响, 而且不具有氧化能力. 所以合理使用葡萄糖氧化酶可以有效防止啤酒的老化、变质, 保持啤酒特有的色香味[16] .6 缩短啤酒发酵周期, 控制双乙酰的含量啤酒中双乙酰含量的高低, 是评价啤酒成熟与否的重要指标, 国家标准( GB 4927- 91) 规定优级啤酒中双乙酰含量必须≤1. 5×10- 5%. 双乙酰还原速度的加快可以缩短成熟期和生产周期, 尤其在旺季, 直接影响啤酒厂的生产效率. 因此, 在发酵过程中如何有效地调控双乙酰的生成和还原,α一直是啤酒生产厂所关注的课题之一.近年来, 采用外加α-乙酰乳酸脱羧酶控制发酵过程中双乙酰的产生, 缩短啤酒发酵周期的方法正逐渐为啤酒厂所接受. 图1 给出了发酵过程中双乙酰的代谢机制和α-乙酰乳酸脱羧酶的作用机理. 由图1 可以看出, 双乙酰主要是由酵母合成缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸时的中间产物——α-乙酰乳酸氧化分解形成的. 在发酵过程中添加α-ALDC 酶后,它可以通过细胞壁、细胞膜渗透到酵母细胞内部, 使α-乙酰乳酸的代谢途径发生改变.α-乙酰乳酸分解生成双乙酰的速度是十分缓慢的, 而α-ALDC 酶的作用则可使α-乙酰乳酸直接快速地分解成乙偶姻, 进而转化成2, 3-丁二醇, 从而大大减少由α-乙酰乳酸生成双乙酰的数量, 缩短双乙酰的还原时间. 同时, 由于α-乙酰乳酸得到了较彻底的分解, 因而可以有效地抑制成品啤酒中双乙酰的回升与反弹, 从而保证啤酒的风味质量[ 18 ～20] .7 促进啤酒的澄清啤酒中的多酚、多肽及二价金属离子等由低分子量向高分子量缩聚, 可引起啤酒的混浊, 其中, 多酚的聚合为主要原因.啤酒中的多酚原来为简单的多酚或多酚二聚体, 如没食子单宁酸、儿茶酸、花白素和栎精等. 这些物质在一定的条件下将进行氧化聚合, 尤其当啤酒中有较多的溶解氧存在, 再加上铜、铁、镍、锡等金属离子的催化与结合, 氧化聚合反应将加速进行. 多酚聚合的同时, 又能以氢键或共价键的形式与多肽相结合, 形成多酚—蛋白质聚合体, 啤酒工艺上称之为混浊母体. 这些混浊母体如以氢键相结合, 则可逆性连接, 在低温条件下结合并使溶解度降低而析出, 呈现雾状混浊, 遇热则复溶, 故称冷混浊. 由于氧化聚合作用的继续进行, 使形成多量牢固的共价键结合, 分子量也逐渐增大, 即会形成不易复溶的絮状或片状混浊物, 称永久混浊[16] . 由啤酒产生混浊的过程可以看出, 氧是啤酒混浊母体形成与结合的促成因素, 因此在啤酒中加入葡萄糖氧化酶可以有效地防止氧化聚合产生混浊, 增加保存期; 也可在贮酒期加入蛋白酶, 分解蛋白质或改变其电性, 使之不与多酚物质结合, 从而有效地防止冷混浊. 我国常用的蛋白酶有菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶等;还有一些进口酶制剂, 在国外应用比较广泛, 如胃蛋白酶复合酶( 美国) 、木瓜酶复合酶( 英国) 、麦芽蛋白酶( 德国) 、霉菌蛋白酶( 日本) . 然而有研究表明, 加入防止冷浑浊的蛋白酶, 会降低啤酒的持泡性[17] . 加拿大Labat t 酿造公司研究人员研制了一种Candida 蛋白酶制剂, 它可以增加啤酒的泡沫稳定性. 因此将上述几种酶结合使用, 可以收到较好的效果[7] .四、实际问题：（一）、麦汁的α-氨基氮问题：α-氨基氮既是原料的主要指标之一，又是麦汁的重要理化指标之一，其原因在于它对发酵是否顺利起着至关重要的作用。