实验一二重组质粒DNA提取双酶切 鉴定凝胶电泳紫外分光法
2 提取大肠杆菌质粒DNA的 方法和原则
2.1 提取质粒DNA的常规方法
(1)SDS碱裂解法 (2)煮沸法
(3) high pure plasmid isolation kit等。
但原理相似，都是利用宿主染色体DNA和质粒 DNA的差异来分离的。
质粒分子的降解作用。（保护作用） ③ Tris•HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作
用）
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溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之
变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性
质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中
纯化
R实N验A一酶二消重化组质除粒去DNRAN提A取，双并酶用切 酚抽提法除去残留的蛋白质
鉴定凝胶电泳紫外分光法
3.2 主要试剂及作用
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•HCl组成.(提过程中的 机械
剪切作用,防止破坏质粒. (保护作用) ② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对
所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较 小及共价闭合环状的性质。
2.3 核酸分离纯化的总原则：
❖ (1) 保证核酸一级结构完整 ❖ (2) 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、
有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）
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3. SDS-碱裂解法提取Puc119-U6重组质粒
菌毛、抗药性等 (3) 它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。 (4) 质粒DNA与宿主菌染色体DNA的两点不同：
★ 宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多 ★ 纯化分离的宿主菌DNA多为线性分子，而质粒
DNA呈闭合环的形式。
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1.4 提取质粒DNA的目的与意义：
基因载体/基因克隆/基因工程
➢ 掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳的原理和步骤；
➢ 掌握紫外分光光度计对DNA含量的测定方法。
一.质粒DNA的提取
1 关于质粒的概念
a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？
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1.1 质粒的定义
质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子， 能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整 合到宿主染色体上。
DNA
3.1 实验原理：
高碱
细菌的细胞壁破裂，内容物释放
①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA； ②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。
①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状； ②双链DNA并不完全分离。
高酸 中和 至中 性
变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物
2.2 分离纯化质粒DNA的主要步骤
(1)培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择）
(2)细菌的收集与裂解 ❖ 收集方法：高速离心的方法 ❖ 裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、 碱变性法、沸水
热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。 根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 纯化方法等因素综合后加以选择。
(3)质粒DNA的纯化 ❖ 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等
实验一二重组质粒DNA提取 双酶切鉴定凝胶电泳紫外分
光法
❖ 基因克隆示意图
分、切
载体DNA ＋
(限制性内切酶切目 开的 ) 基因
接
＋
重组体
宿主细胞
转
已转化的宿主细胞
繁殖
筛
阳性克隆株
实验一鉴二定重凝组胶质电粒泳D紫N外A表分提达光取法双酶切
基因工程
❖ 定义：
实现基因克隆所采用的方法及相关的工 作统称为重组DNA技术，又称重组DNA技术。
在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。
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1.2 质粒的三种构型
(1) 超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA)
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(2) 开环DNA (open circular DNA, OC DNA)
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生 旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
实验内容
1.质粒DNA的提取与纯化(P70碱法)
2.限制性内切酶的酶切鉴定(P83)
3.定性鉴定:DNA 的琼脂糖凝胶电 泳(P28)
4.定量检测：DNA 的紫外分光光度法 测定(P37)
实验目的
➢ 掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的 作用 ;
➢ 掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切 酶
3.3
加1.5ml培养物于EP管，12000g×30S
实 除去上清，加入冰的200 µl 溶液I，剧烈振荡EP管，室温3min
验
加入200µl 溶液II，快速颠倒数次，冰浴3min
步 骤 加入150µl 冰溶液III，温和振荡10s，冰浴5min，12000g×5min
（DNA变性作用）
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溶液III：HAC(乙酸)和 KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液 (复性，分离)
①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。
②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
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(3) 线状DNA (linear DNA, L DNA):
如果两条链均断开，即为线状DNA。
电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）
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最慢
中
最快
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1.3 质粒DNA的一般特性：
(1) 质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 (2) 它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型：
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基因载体 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质
粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus) 柯斯质粒。这些载体均需经人工构建，除去致 病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行 筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
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