《基因工程的基本原理学案》《基因工程的基本原理学案》张建尚/江苏【学习目标】站得高——明确学习目标。
1.简述DNA重组技术所需的三种基本工具。
2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
3.简述基因工程原理及基本操作程序。
4.尝试设计某一转基因生物的研制过程。
【重点和难点】重点：1.DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。
2.基因工程基本操作程序的四个步骤。
难点：1.基因工程载体需要具备的条件。
2.从基因文库中获取目的基因和利用PCR 技术扩增目的基因。
【学法提示】1.联系DNA分子的结构，理解限制酶、DNA连接酶和载体的作用及特点，准确画出限制酶切割产生的末端；通过比较掌握DNA连接酶和DNA聚合酶的作用特点。
①、②③和④。
4.获取目的基因的方法有以下几种：①、②、③。
基因表达载体的构建是基因工程的④，一个基因表达载体的组成除了⑤外，还必须有⑥、⑦以及⑧等。
其中⑨是RNA聚合酶识别和结合的部位。
5.将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是①，②是转基因动物中采用最多，也是最为有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法。
转化大肠杆菌细胞时要先用③处理细胞，使其成为④细胞。
用⑤方法可以检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，用⑥方法可以检测目的基因是否转录出了mRNA，用⑦方法可以检测目的基因是否翻译成蛋白质。
除了上述分子检测外，有的还需要进行⑧的鉴定。
答案1.①限制性核酸内切酶（限制酶）②双链DNA③特定核苷酸序列④磷酸二酯键⑤黏性末端⑥平⑦DNA连接酶⑧双链DNA片段⑨磷酸二酯键⑩分子运输车⑾质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒2. ①限制酶切割位点②自我复制③同步复制④遗传标记基因⑤鉴定和选择 3.①目的基因的获取②基因表达载体的构建③将目的基因导入受体细胞④目的基因的检测与鉴定4.①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成④核心⑤目的基因⑥启动子⑦终止子⑧标记基因⑨启动子5.①农杆菌转化法②显微注射法③Ca2+④感受态细胞⑤DNA分子杂交⑥分子杂交技术⑦抗原-抗体杂交⑧个体生物学水平【课堂探究】走得欢——探索成长快乐。
一、DNA重组技术的基本工具1.分析回答下列问题：（1）从噬菌体侵染细菌的实验来看，细菌等原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但这类原核生物没有绝灭，其保护机制是①。
（2）限制酶不能任意切割DNA 分子的原因是 ① 。
（3）已知限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是-G ↓GATCC-，请画出该酶切割 所产生的黏性末端。
2.比较：DNA 连接酶 DNA 聚合酶作用对象 连接 ① DNA连接 ② DNA作用部位 将DNA 双链上 ③ 个缺口连接起来 将 ④ 个核苷酸加到已存在的核酸片段上 模板 ⑤⑥共同点⑦3.思考并回答问题：（1）为什么不能把单独的DNA 片段直接导入受体细胞？ ① 。
如果选择的载体没有限制酶切割位点，能否制作出重组DNA ？ ② 。
（2）能否选用从霍乱弧菌中分离出来的质粒做载体？ ① 。
（3）我们用肉眼不能直接观察到载体进入受体 ① GGATC细胞，那如何鉴定呢？ ① 。
二、基因工程的基本操作程序 完成基因工程的基本操作流程图，并回答问题：（1）填写图中a ～e 的内容。
（2）PCR 过程中利用 ① 使DNA 解链为单链，所用DNA 聚合酶的特点是 ② ，需要的引物有 ③ 种。
（3）右图是基因表达载体模式图，图中1是① ，作用是 生物材料DNA a ① 一定大小范围DNA PCR cDN A 基因文库 基因组文库 c ③ 人工合成 获取目的基因 d ④ 导入受体细胞 得到转基因生物 b ② 限制酶切割 包括 复制1 抗生2②，2是③，作用是④。
抗生素基因的作用是⑤，目的基因应该插入在⑥之间。
（4）如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的①中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的②上。
受体细胞若是体细胞则可以通过③技术获得个体，而动物基因工程的受体细胞通常是④。
在用表达载体转化大肠杆菌时，常用⑤处理大肠杆菌，以利于表达载体进入。
（5）用①方法可以检测目的基因是否整合到染色体DNA上，为了检测目的基因是否转录出了mRNA，可用标记的目的基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为②，为了检测目的基因转录的mRNA是否翻译成③，常用抗原-抗体杂交技术。
检测抗虫基因是否导入棉花体内，简便方法是④。
答案一、1.（1）①细菌细胞内的限制酶能切割侵入的噬菌体DNA ，使之失去遗传作用（2）① 限制酶具有特异性，能够识别特定核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA 分子（3）①2.①双链②单链③两④单⑤不需要模板⑥以一条DNA 链为模板⑦都能形成磷酸二酯键3.（1）①直接导入的DNA 片段不能复制，也容易被受体细胞水解②不能（2）①不能（3）①利用载体上特殊的遗传标记基因进行鉴定和选择二、（1）①mRNA ②反转录③cDNA 文库④构建表达载体⑤目的基因的检测与鉴定（2）①高温②耐高温③2（3）①启动子②是RNA 聚合酶识别和转录的部位，驱动基因转录出mRNA ③终止子④终止基因转录⑤为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来⑥启动子与终止子（4）①T-DNA ②染色体的DNA ③植物组织培养④受精卵⑤Ca 2+（5）①DNA 分子杂交②分子杂交技术③蛋白质④用棉花叶直接饲喂害虫 【知识体系】 G基因工程的基本原理 基本工具 基本操作程序 DNA 分子杂交 RNA-DNA 分子杂交 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因 导入受体细胞 目的基因的从基因文库中获取 PCR 扩增 化学方法目的 构导入植物细胞 导入动物细胞 限制性核酸内切酶 DNA 连接酶 分子水平 个体农杆菌转化法 显微注射法【课堂巩固】跑得快——善于学习，手不释卷！ 为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。
我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。
（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA 分子所用 C T G C A G a b 533的限制性内切酶作用于图中的处，DNA 连接酶作用于处（填“a”或“b”）。
构建重组DNA分子的载体一般选用病毒或，后者的形状成。
构建重组DNA分子时应将目的基因插入到载体上的和之间。
（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法。
（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用技术。
（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的做探针进行分子杂交检测，又要用方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。
（5）已知限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点—GGATCC用酶I和是-↓GATC-。
在目的基因的左侧有酶Ⅰ的一个切点，右侧各有酶Ⅱ的一个切点（如下图所示）。
请画出目的基因两侧被限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ同时切割后所形成的黏性末端。
答案（1）a ；a ；质粒；小型环状；启动子；终止子（2）基因枪法（花粉管通道法）（3）植物组织培养（4）耐盐基因（目的基因；一定浓度的盐水浇灌（移植到盐碱地中）（5）【课后作业】步步高——巩固成果，对答如流！ （2008海南）右图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI 、BamHI 的酶切位点，amp R 为青霉素抗性基因，tct R 为四环素抗性基因，P 启动子，T 为终止子，ori 为复制原点。
已知目的基因的两端分别有包括EcoRI 、BamHI 在内的多种酶的酶切位点。
据图回答：（1）将含有目的基因的DNA 与质粒表达载体分别用EcoRI 酶切，酶切产物用DNA 连接酶进行连接后，其中由两个DNA 片段之间连接形成的产物有 、 、 三种。
若要从这些连接产物中分离出重组质粒，—GGATCC —……—GATC — —G用酶I 和 目的基因 T oamp tct R P Eco Bam需要对这些连接产物进行。
（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。
之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是；若接种到含青霉素培养基中，能生长的原核宿主细胞所含的连接产物是。
（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是，其合成的产物是。
（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是。
答案（1）目的基因—载体连接物；载体--载体连接物；目的基因--目的基因连接物；分离纯化（2）载体--载体连接物；目的基因--载体连接物、载体--载体连接物（3）启动子；mRNA （4）EcoRI和BamHI解析（1）目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切后产生的黏性末端相同，此时在DNA连接酶的作用下会产生自身环化或形成串联寡聚物，由于题中求的是“两个DNA片段之间连接形成的产物”，可排除自身环化这一情况，得到目的基因与目的基因、目的基因与质粒表达载体、质粒表达载体与质粒表达载体三种连接物。
（2）由于质粒上的抗四环素基因被EcoRI切断失去作用，所以目的基因—载体连接物和目的基因--目的基因连接物也就失去抗四环素的作用，只有载体—载体连接物修复了抗四环素基因，使受体细胞（原核宿主细胞）能够在含四环素的培养基上正常生长。
EcoRI没有破坏抗青霉素基因，所以导入基因—载体连接物和载体—载体连接物的原核宿主细胞能够在含有青霉素的培养基上正常生长。
（3）如果用EcoRI、BamHI 两种限制酶同时处理目的基因的DNA和质粒表达载体，分离出的目的基因和质粒表达载体各自具有两个不同的黏性末端，而对于目的基因和质粒表达载体来说两者的黏性末端是一致的，在DNA连接酶作用下它们相互联结,使相匹配的切点相互补,而不至于发生自身环化产生定向重组体。
（4）如果用EcoRI、BamHI两种限制酶同时处理目的基因的DNA和质粒表达载体，分离出的目的基因和质粒表达载体各自具有两个不同的黏性末端，而对于目的基因和质粒表达载体来说两者的黏性末端是一致的，在DNA连接酶作用下它们相互联结,使相匹配的切点相互补,而不至于发生自身环化产生定向重组体。