2.自动合成矮茶素库
运用广泛的生物催化反应对类黄酮矮茶素进行衍生化， 可以自动、 反复地合成得到一个含 600 个衍生物的库。 利用一种多探头液控自动仪在 96 - 槽平板中对候选生 物催化剂进行初始筛选 ,发现有 16个纯化的酶和25个 微生物能够接受矮茶素为底物。利用这些酶来改变矮 茶素，所得的衍生物即产生了一个多样化的库(图4) 。
组合生物催化
（Combinatorial Biocatalysis）
汇报内容：
1.组合生物催化的理论基础与特点 2.组合生物催化的类型
3.组合生物催化的关键技术
4.组合生物催化的实例
5.结论与展望
一、组合生物催化的理论基础和特点
理论基础：
在自然界的生物体内，很多次生代谢物往往是一些小分 子的初级代谢产物经过由不同的酶参与的代谢途径而转 化生成。例如，生物碱就是初级代谢产物氨基酸通过生 物合成途径产生的。受这种现象的启发，一种新的合成 方法逐渐发展完善起来，这就是组合生物催化。只不过 生物合成途径是在生物体内完成的，而组合生物催化是 在体外完成的。
图4.青霉素乙酰化酶从脂蛋白保护基团上脱 除酶标基因
3.固定化酶催化
在固相表面进行的组合合成反应是建立具有丰富差异性的化合 物库所用的最有效的方法之一，多聚体-支持物合成后通过使 支持物与合成的化合物之间的连接基团断裂的方法而将得到的 库释放到溶液中去。在过去的几年中，许多具有酶稳定性的连 接子研制成功，从而为把化合物自支持物上释放出来提供了一 种可选的方案。根据最近的分类方法，酶稳定性的连接子可被 分成两类，即外连接子和内连接子。如图5、6所示。
酶活化技术：
1.盐活化法
例子：在正已烷中，非缓冲盐对枯草溶菌素催化的N-乙酰基-L -苯丙 氨酸乙酯和正丙醇的转酯化反应的影响。具体如下：制备含98%盐 的生物催化剂时，将酶和KCI一起冷冻干燥，使得枯草溶菌素的催化 性质Kcat/Km提高了3 700倍以上。该技术已被延用到非丝氨酸蛋白 酶(包括嗜热菌蛋白酶) ,取得了类似的活化性质。例如 ,盐活化的嗜热 菌蛋白酶已被用于紫杉醇2p- 酯基衍生物的合成。与天然的嗜热菌蛋 白酶相比，紫杉醇在叔戊醇中的酰化活力提高了20倍。盐活化的枯 草溶菌素也被用于选择性的酰化矮茶素、腺苷、3 - 羟基托烷和双环 [2. 2. 2 ]辛- 5 - 烯 – 2,3 - 二甲醇。这样，盐活化法代表了一种活化 酶的普遍技术 ,它使复杂分子能在有机介质中利用酶的催化特性进行 酰化。
Figure 8. Standalone Tyc TE domain catalyzes the chemoenzymatic synthesis of cyclic peptides from the linear precursors.
• 所谓组合生物催化，就是系统地利用生物催化技术对天 然产物或合成化 更佳的新化合物。 • 组合生物催化的核心是生物催化，“组合”不过是一种 合成的策略。
组合生物催化和组合化学的关系：
联系：组合生物催化是酶催化、化学催化和微生物转 化在组合化学中的应用，即通过对先导化物发现和优化的库的生成。这些多样 的结构例证了如何利用组合生物催化产生新的库。
图3.几个已在组合生物催化中用于库生成的先导分子的例子
2.酶作为组合生物合成的脱保护工具
酶作为组合生物合成的脱保护工具，使得基团特异的选择性能 够在温和的条件下进行，也使其能够应用于最脆弱的分子。复 合脂肪多肽的多步合成中生物催化脱保护的这些优势得到体现， 青霉素酰化酶应用于高度标记的S-软脂酰化的寡肽的选择性N脱保护，如图4所示，随后进行的是酶催化除去4-（苯基丙酮） 苄氧基羰基保护基团， S-软脂酰化的寡肽作为进一步合成步骤 的构建单元，包括偶联另一个单独固相合成的寡肽连相似的酶 脱保护策略成功应用于酸标记和碱标记的核酸多肽的制备。
2.化合物的快速分析鉴定
由于组合生物催化的目的在于建立化合物，所以产物数量较大，常规的分析鉴定方法不能满足需要。在组合生物催化中使用 的快速分析鉴定方法有高通量质谱分析（一个样品/min）、用于 在线鉴定的高效液相色谱--质谱联用技术等。另外，新的分析鉴 定技术的开发和应用，如液相色谱—核磁共振联用技术必然会促 进组合生物催化的发展。当然，要根据产物的结构不同来选择具 体的方法。
组合生物催化的特点：
●广泛的反应可能性;
●高区域选择性和立体选择性
●单步反应 ●自动方便
,能进行位控修饰;
,避免了保护和脱保护步骤; ,在温和均匀的条件下 ,反复进行单步反应;
●反应条件温和
●活性高
,适宜于复杂、 不稳定的分子;
,这样催化剂的浓度低;
●酶催化剂固定化后可以循环利用; ●酶能被环境完全降解;
三、关键技术
1.微生物技术和酶技术
组合生物催化的核心技术就是生物催化。生物催化是指利用 生物体系或其产生的酶体系对外源性化合物进行结构修饰的生物 化学过程。用于组合生物催化的生物体系最多的一种是微生物体 系，包括微生物的采集、分离、培养、鉴定、保存等关键技术。 由于有些催化反应要在非水介质中进行，而微生物又难于在 其中生长，所以对于这些反应需用纯化的酶进行催化。酶的来源： 1.购买；2.发酵，分离纯化。为了提高酶在非水介质中的活力， 需要对酶进行固定化处理。
四、组合生物催化实例
1. 从聚苄酯获得酰胺库
Adamczyk等人曾报道,利用脂酶(特别是洋葱假单胞菌Pseudomonas
cepacia 脂酶)来产生一个酰胺库。以芳香二酯，二苄基 - 1 ,2 - 苯二 氧二醋酸酯为核心物 ,以单 - (N - 叔丁氧羰基)二胺作为二酯的反应伴 体。该二酯和五个单 - (N - 叔丁氧羰基)二胺的混合物反应生产一个 26个不同产物的库 ,包括15个双酰胺 ,5个单酰胺单酯和五种较少量的 单酸产物。此例说明洋葱假单胞菌Pseudomonas cepa2cia 脂酶具 有将苄酯转变成酰胺的广泛的专一性 ,这样完成了一个双酰胺库的组 合合成。
区别：在原理和方法上都有明显的区别，组合化学主 要通过某种反应进行合成，常常有多种化合物参与反 应，而组合生物催化主要通过多种生物催化方法对某 种化合物进行衍生，通常情况下先导化合物只有一个。
图1 组合生物合成新的生物分子的途径 (a)从自然界的合成子; (b)从细胞外的先导化合物 在自然模式下，创造新的有机分子所需时间太长，不适宜于药物发现的研究。 组合生物催化就是要加速这个自然模式，且将其运用于发现并优化医药和农 业化合物中。如图1b所示，这种方法能够利用天然催化剂(酶或完整细胞)丰 富的多样性，以及一些生长迅速的重组的和工程酶，对一些有希望的药物和 农用化合物的先导物直接进行衍生化(注意区分组合生物催化和组合物合成， 后者是指在活的微生物中，通过生物合成途径的基因工程方法，从天然产物 产生新的分子) 。
酶(治疗痛风和多种硬化症的潜在标耙)和尿激酶(一种抗癌标耙)
在内的某些标耙进行生物活性筛选。在起初的筛选中，发现了 对这些标耙的抑制作用比矮茶素高两个数量级的新的抑制剂 ， 然后又对其最有效的衍生物进行再合成和确证。
3.医药化合物的生物催化合成
肽的环化作用：
几乎所有的非核糖体多肽合成酶（NRPS）都具有环化作用， 这是终端硫酯酶(TE)结构域起作用的，线性肽的区域选择环 化是那些具有药用作用的化合物必不可少的，但是很难通过 化学方法来合成。随着多种TE结构域的发现及其作用机理 的研究，发现可以利用带有TE结构域的NRPS通过生物合成 途径大量生产环肽，或利用某些分离出来的TE结构域对化 学合成的多肽底物进行环化，以获得所需的环肽。因此，终 端硫酯酶(TE)已经被作为一个独立的具有环化作用的生物催 化剂。许多环形肽利用NRPS已经从固相多肽合成中得到。
图2 .先导化合物可能进行的生物催化转化 (L 代表先导核心)
所示的这些途径所有可能反应的一部分,其目的为了说明仅由生 物催化所产生的一些衍生物 (注:X= CI ,Br 或 I ;Vin =乙烯基)
组合生物催化中常见的反应类型：
二、组合生物催化的类型
1.非水介质中的生物催化
在组合合成平台使用生物催化剂的一个最大障碍是欲修饰的很多底 物难溶于水，而大多数酶体系的微环境是水，这些酶在有机溶剂中 的催化活性大大降低，因此能够使酶在水环境中发挥合成功效的方 法常常使得反应在有机溶剂中无法进行。利用非水介中可以保持其活性， 但是其催化效率通常比水中要低几个数量级。但近来的研究表明， 适当地控制酶的微环境可以大大提高酶在有机溶剂中的活力。
可溶性的多聚支持物表面的低聚糖在胰凝乳蛋白酶的作用下，
被释放到溶液中，酶的作用位点是内连接子上的苯丙氨基酸残 基标记基团。基于外连接子的合成策略已经被证实是一些能被
青霉素酰基转移酶、脂肪酶作用的小分子。虽然酶法裂解已经
被成功应用于可溶性及不可溶性的多聚体支持物，但是由于相 对大的酶分子难以进入聚合物串珠样结构的内部而使得合成的 化合物不能完全释放，酶在固相载体上的应用仍受到限制。
2.表面活性剂
即指利用低浓度的表面活性剂将酶溶解。虽然酶在几乎所有的有
机溶剂中都不溶解(但是具有一定的活力)，表面活性剂的存在会
形成疏水性的离子对，这样使酶溶解在疏水性的溶剂中。与悬浮 的天然酶相比 ,枯草溶菌素在辛烷中的催化活性被提高了四个数
量级。离子配对的酶在有机溶剂中的溶解性对组合生物催化应用
组合生物催化的优势主要是通过生物催化剂—酶反应的特点来
体现。酶的最大优点在于它具有高度的选择性，这样既可以免 去在对某些多官能团先导化合物修饰中繁琐的基团保护和去基 团保护，又可以保护先导化合物的手性特征不至于被破坏，适 合一般都要求一定的立体结构，而酶法修饰正好可以满足这方 面的需求；另外酶反应还具有效率高、收率高和副产物少的优 点。相比剧烈的化学反应，温和的酶反应条件对于那些热敏感 的先导化合物的合成也有很大的优势。
两类连接子都包括一个标记基因，它能使靶健被酶 所识别，但是它们的不同之处在于健实际断裂的的 方式不同。内连接形成的健被酶直接识别为作用的 靶点，而外连接的健则通过生成中间体再由中间体 自发碎裂而释放目的化合物。内、外连接的化学反 应式见图5、6。