实验性毕业论文范例文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-学号:泰山医学院毕业设计（论文）题目：蜂胶黄酮抗H2O2诱导PC12细胞凋亡机制的研究院（部）系药学院所学专业药学年级、班级完成人姓名指导教师姓名专业技术职称2013年 6 月 18 日论文原创性保证书我保证所提交的论文都是自己独立完成，如有抄袭、剽窃、雷同等现象，愿承担相应后果，接受学校的处理。
专业：班级：签名：20 年月日摘 要目的 观察蜂胶黄酮对过氧化氢（H 2O 2）诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC 12）凋亡的影响及机制。
方法 培养PC 12细胞，取对数生长期细胞分为五组，空白对照组、模型组、蜂胶黄酮高、中、低剂量组，剂量分别为200mg/L 、100 mg/L 、50 mg/L.药物预处理2h 后，孵育H 2O 2（140μmol/L）24h 诱导过氧化损伤。
TUNEL 试剂盒检测原位细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞内活性氧水平以及细胞周期，ELISA 检测细胞内Caspase-3蛋白含量。
结果 TUNEL 细胞凋亡染色显示, H 2O 2组与空白对照组比较染色明显加深,而蜂胶黄酮组染色明显变浅，说明蜂胶黄酮能对抗H 2O 2诱导细胞凋亡；周期结果显示H 2O 2组处于G0/G1细胞明显增多，而处于G2/M 、S 期细胞明显减少，细胞增殖降低，而蜂胶黄酮增加S 期细胞促进细胞增殖；与空白对照组相比H 2O 2组活性氧水平、细胞内Caspase-3含量明显增高，而蜂胶黄酮各剂量组活性氧水平降低，Caspase-3含量减少。
结论 蜂胶黄酮对H 2O 2诱发PC 12神经细胞凋亡有显着的抑制作用，其机制可能其影响细胞周期、清除氧自由基、降低凋亡因子Caspase-3有关。
关键词 蜂胶黄酮；PC 12细胞；H 2O 2;Caspase-3；细胞凋亡AbstractObjective :To observe the protection ofpropolis flavonoidson rat with injuried pheochromocytomacells(PC 12) induced by?hydrogen peroxide(H 2O 2) and to explore its possible mechanism.Methods:Culture?PC 12 cells,the cells inthe logarithmic growth phase weredivided into five groups,blank control group,model group,propolis flavoneof high,medium and low dose group,the dose of 200mg/L,100 mg/L,50 mg/L.After 2h 0fPharmacological preconditioning,the cellswere incubated with H 2O 2(140 μ mol/L)for24hto induceoxidative damage.TUNEL Kitis used fordetermining Cell apoptosis,Flow cytometry was used to detect the intracellular ROS level and cell cycle,ELISA is used for determining the concentration of protein Caspase-3 in cells.Results:Apoptosis of TUNEL cells staining, H 2O 2 group compared with the control group, staining was deepened, and the propolis flavone group was significantly lighter, that propolis flavonoids can antagonize the apoptosis induced by H 2O 2 Cycle showed that H 2O 2 group in G0/G1 cells were increased, and in the G2/M,S phase cells decreased significantly, reduced cell proliferation, and propolis flavonoids increased S phase cells promoting cell proliferation; compared with the blank control group, caspase-3 in H 2O 2group, the levels of reactive oxygen species in cells increased significantly, while the propolis flavone in all dose groups decrease the levels of reactive oxygen species, reduced caspase-3 content.Conclusion : Propolis flavonoids on H 2O 2-induced PC 12 cells damage a significant protective effect,The mechanism may be its effect on cell cycle, scavenging oxygen free radicals, decrease the apoptosis related factor caspase-3.Key words : Propolis; flavonoids; PC 12 cells; H 2O 2; apoptosis目录正文 (01)1前言 (01)2仪器与试剂 (01)3实验方法 (02)3.1 蜂胶总黄酮的提取与含量测定 (02)3.2 PC细胞的培养及分组给12药 (02)3.3 TUNEL细胞凋亡原位检测 (02)3.4流式细胞仪检测细胞周期 (02)3.5流式细胞仪检测细胞内活性氧水平 (03)3.6 ELISA试剂盒检测细胞内Caspase-3蛋白含量 (03)4实验结果 (03)4.1 TUNEL细胞凋亡原位检测 (03)4.2流式细胞仪检测细胞周期 (04)4.3流式细胞仪检测细胞活性氧水平 (05)4.4 ELISA检测细胞内Caspase-3蛋白含量 (06)5讨论 (07)6结论 (08)参考文献 (09)文献综述 (10)致谢 (15)蜂胶黄酮抗H2O2诱导PC12细胞凋亡机制的研究学生：*** 指导教师：***（泰山医学院药学院，泰安 271016）1 前言老年性痴呆 (Alzheimer′s disease, AD) 是一种以进行性认知功能障碍和记忆能力受损为主的中枢神经系统退行性疾病。
该病严重威胁中老年人的健康，对社会和经济造成巨大压力。
因此，研究AD发病机制及寻求有效药物防治已成为目前世界医药界的热点和难点。
氧化应激损伤神经元在神经退行性病变中具有重要的病因学意义。
研究表明老年性痴呆与氧化应激损伤密切相关。
H2O2是和氧化应激反应密切相关的活性氧之一，它参与了许多神经系统疾病的发病，与多种疾病如自身免疫病，肿瘤，炎症以及细胞凋亡的发生有关，长期用作神经细胞氧化损伤的诱导剂。
蜂胶(Propolis) 被誉为“紫色黄金”，是蜜蜂从植物新生枝嫩芽或花蕾处采集的树脂类物质，掺入其舌腺及蜡腺分泌物，经蜜蜂反复混合而成的胶状物质。
蜂胶富含多种具有药用价值的活性成分，其中主要是黄酮类化合物。
本课题组前期研究发现蜂胶醇提物对东莨菪碱、亚硝酸钠、三氯化铝诱导的小鼠学习记忆障碍模型具有明显保护作用，对D-半乳糖诱导衰老模型小鼠学习记忆功能也有保护作用，其作用机制可能与其对抗小鼠体内过氧化反应有关[1-2]。
通过MTT、流式细胞术等前期研究也发现蜂胶黄酮能有效的保护H2O2诱导的PC12细胞损伤，提高细胞存活率，抑制细胞凋亡，为进一步研究其抗痴呆作用奠定了基础。
PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，在细胞形态，结构，功能上与多巴胺神经元有许多相似特征，能够表达多巴胺转运体，是体外神经细胞损伤及保护作用研究使用最为广泛的细胞系。
本实验拟培养大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞株，以H2O2诱导神经细胞损伤，蜂胶黄酮干预， TUNEL 染色观察蜂胶黄酮的抗凋亡作用，并通过检测细胞周期、活性氧及Caspase-3对蜂胶黄酮的抗凋亡机制进行研究。
2 仪器与试剂2.1 材料和试剂蜂胶原胶，购自山东省实验种蜂场；PC12细胞（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株），购自南京凯基生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶、PBS,购自于索莱宝；完全DMEM 培养基、新生牛血清(NBS)，购自于南京凯基生物技术有限公司；TUNEL细胞原位凋亡测定试剂盒、活性氧试剂盒及细胞周期检测试剂盒（购自于南京凯基生物技术有限公司）、ELISA试剂盒（蓝基生物技术有限公司）。
其它试剂均为分析纯。
2.2 仪器二氧化碳孵箱（Thermo）；单人双面超净工作台（SW-CJ）；倒置式生物显微镜（XDS-1B）；酶标仪（Infinite f200）；流式细胞仪（FACSCalibur）；高速离心机（TGL-16G）；数控超声波清洗器（KQ-600DB）；旋转蒸发仪（RE-52A 上海亚荣生化仪器厂）、恒温干燥箱（施都宝Bao-80A）、恒温水浴锅(HW.SY21-K)、超低温冰箱（Thermo）。
3.实验方法3.1蜂胶黄酮的提取与含量测定取蜂胶50g粉碎，用85%乙醇浸泡4天，配料比蜂胶（g）：85%乙醇（ml）为1:30，在30℃条件下超声50min后，旋转蒸发仪蒸发成浸膏状，冰箱4℃内保存备用。
以芦丁为标准品，得标准曲线y=13.656x+0.0404， R2=0.9969，计算蜂胶中黄酮含量为：4.86mg/g。
3.2 PC12细胞的培养及分组给药在37℃，恒湿的5%CO2细胞培养箱内培养PC12细胞，完全培养基为高糖DMEM培养基中含10%新生小牛血清，加入100 μg/ml链霉素和100 μg/ml氨苄青霉素。
细胞为上皮样贴壁生长，每2～3 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。