抑菌圈
第六章 第四节 代谢产物鉴定
代谢产物鉴定
在菌种分离工作中，有些产物的产生菌可以通过与指示 剂、显色剂或底物等的生化反应在平皿上直接进行定性分离，
这样分离到的菌种基本上具有所需要的生产性能。这种分离
方法实际上已经包含了一部分筛选内容。
第六章 第四节 代谢产物鉴定
但并不是所有产物的产生菌都可以应用平皿定性方法进 行分离。对于这一类不能应用平皿方法进行定性分离的菌种，
第六章 第三节 纯种分离
利用生化反应进行分离：
这是利用特殊的分离培养基对微生物进行初步分离的方
法。 根据目的微生物的特殊生理特性或其代谢产物的生化反 应进行设计。 通过观察微生物在特殊分离培养基上的生长情况或生化 反应进行分离，可显著提高目的微生物分离纯化的效率。
第六章 第三节 纯种分离
常用方法： （1）透明圈法（培养基浑浊）
第六章 第二节 富集培养
富集培养主要根据不同种类微生物对碳氮源、 pH 值、 温度、需氧等生理因素的要求不同进行控制。富集培养又称 为施加选择压力分离法。
富集培养多应用于筛选水解酶产生菌。这类微生物具有 很强的分解有机碳或有机氮的能力，从中取得营养，得到优 先生长繁殖。 如：蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等产生菌种。
b、极端条件
如：高温酶←嗜热菌←热环境←温泉、火山附近
第六章 第二节 富集培养
富集培养 在自然界获得的样品，是很多种类微生物的混杂物，一
般采用平板划线法或稀释法进行纯种分离。 但在大多数采集的样品中，所需微生物不是优势菌种或 数量很少。 为了增加分离成功率，通常通过富集培养增加待分离菌 种的数量。 富集培养：根据待分离菌种的特点，设计的一种选择性 培养基，使目的微生物得到迅速地生长繁殖，在数量上占优 势。
纯种分离
种，必须对富集培养后的样品进行纯化分离。
第六章 第三节 纯种分离
纯种分离的基本方法： 纯种分离通常采用梯度稀释涂布法和划线法。 划线法是用接种针挑取微生物样品在培养基上直接划线 （一般采用梯度划线法），培养后获得单菌落。划线法简便、 快速，但所得到的单菌落不一定是纯种（可采用多次转接划 线加以弥补）。
思考题： 1、工业微生物的来源？ 2、土壤采样方法？ 3、富集培养？
4、纯种分离的方法？
5、生化反应筛选的几种方法？
第六章
工业壤、空气、江、河、湖、海等； （一切可收集的气、液、固状态物质） ②菌种保藏机构； ATCC（美国标准菌种收藏所） ACCC （中国农业微生物菌种保藏管理中心 ）等 ③发酵制品。 （如：从泡菜中筛选乳酸菌，从酒曲中筛选酯化酶产生 菌）
需要进行常规生产性能测定。另外，即使已通过平皿定性分
离的菌种也需要进一步筛选和更加精确的定量测定。
第六章 第四节 代谢产物鉴定
生产性能测定分为初筛和复筛。 初筛要求筛选的菌株尽可能多，筛选的菌株越多，就越 有希望筛选到所需要的菌株。由于初筛时筛选的菌株很多， 工作量很大，所以，为了提高筛选效率，需要设计一种快速、
1、从土壤中采样
d、不同季节 春：较少
夏：较多
秋：最多（气温、营养物质）
冬：最少
第六章 第一节 采样
1、从土壤中采样
e、采样方法 铲除表层5cm以内的浮土
取5-25cm内的土样10-15g
用无菌器皿包装并标记：地点、土质、植被、时间等
取样后应尽量尽快分离，如果时间确实难以满足可以
先“培养”，再分离。
生物数量也较少。 土壤中数量最多的是细菌，其次是放线菌、真菌。
第六章 第一节 采样
1、从土壤中采样
a、土壤有机质和通气状况 有机质营养丰富则微生物数量多；
通气状况好则好氧微生物多，反之则厌氧微生物多；
耕作土一般细菌、放线菌较多；
林间落叶、草丛一般霉菌、酵母菌较多；
采样深度一般在5-25cm内。
第六章 第一节 采样
（2）变色圈法（指示剂或显色剂）
（3）生长圈法（采用营养缺陷菌作为指示） （4）抑菌圈法（抗生素敏感菌作为指示）
第六章 第三节 纯种分离
第六章 第三节 纯种分离
第六章 第三节 纯种分离
第六章 第三节 纯种分离
第六章 第三节 纯种分离
第六章 第三节 纯种分离
药敏试验
第六章 第三节 纯种分离
第六章 第二节 富集培养
富集培养对那些样品中含有的目的微生物数量较少的样 品是必要的。
但如果按通常分离方法，在培养基平板上能出现足够数
量的目的微生物，则不必进行富集培养，直接进行纯化分离 就可以了。
第六章 第三节 纯种分离
富集培养以后的样品中目的微生物虽然已占了优势，但 其他微生物仍然存在。因此，为了获得某一特定的微生物菌
简便的筛选方法。初筛可以采用摇瓶培养法，也可以采用固
体培养法。初筛时产物测定可以采用琼脂平板测定法。
第六章 第四节 代谢产物鉴定
通过初筛得到的较好菌株，需要进一步进行筛选，即复 筛。复筛通常采用摇瓶振荡培养法，而且一个菌株要接种 3-
5 个摇瓶（平行实验，确保数据准确），培养后的产物测定
要采用精确检测法。在复筛过程中，也可以结合多种培养基 和培养条件如培养基、温度、 pH 值、供氧量等进行筛选。
1、从土壤中采样
b、土壤酸碱度和植被情况 偏酸性土壤：霉菌、酵母菌；
偏碱性土壤：细菌、放线菌；
不同植被情况下优势微生物情况不同：
果树下酵母菌较多；
豆科植物下根瘤菌较多；
第六章 第一节 采样
1、从土壤中采样
c、地理条件 南方土壤较北方土壤中微生物数量多；
顺序：热带—亚热带—温带—寒带
第六章 第一节 采样
还可以根据目标微生物对 pH 值、温度及某种营养物质 利用的专一性不同进行控制培养，达到分离纯化的目的。
第六章 第二节 富集培养
在富集培养中，除了控制营养物质外，还可以控制培养 的外部条件，如温度、压力、添加抗生素等“添加物”等方 法减少非目的微生物的数量，达到富集的目的。 如从土壤中分离芽孢杆菌，可采用控制温度的方法。 如分离细菌时，加 50u / mL 制霉菌素或 30u / mL 多 灵菌，抑制霉菌、酵母菌生长。 如分离放线菌时，加几滴 10 ％酚，抑制霉菌和细菌生 长等。
稀释法是先将样品经无菌水或灭菌生理盐水 梯度稀释后，
再涂布到固体培养基上，培养后获得单菌落。稀释法使微生 物样品分散更加均匀，获得纯种的概率更大。
第六章 第三节 纯种分离
划线法1
第六章 第三节 纯种分离
划线法2
第六章 第三节 纯种分离
涂布法
第六章 第三节 纯种分离
通过控制营养和培养条件进行纯种分离： 这一步一般都采用筛选性平板辅以筛选性培养条件。 （1）控制分离培养基中的营养成分（碳氮源） （2）控制培养基的pH值（采用缓冲体系） （3）控制培养温度 （嗜热性、大类特性如细菌35，霉菌27度） （4）供氧条件的控制（厌好氧）
第六章 第一节 采样
2、根据微生物生理特点采样
不同微生物对碳源、氮源、氧等的要求不一样，分布上 就有很大的差异。要根据筛选目的确定如：
纤维素酶产生菌：林间落叶、草丛茂密处等附近；
碳氢化合物分解菌：油田附近；
酵母菌：果园内；
高温菌：温泉、火山、堆肥等附近；
第六章 第一节 采样
3、在特殊环境下采样
a、局部条件 如：白蚁肠道→筛选→木素降解菌
低温（南极-18～-23℃不冻湖 ——冷育微生物 ——蛋 白质合成过程对冷呈稳定性 ）
第六章 第一节 采样
1、从土壤中采样
一克土壤里就有数亿个微生物，即使在荒无人烟的沙漠， 一克砂土中也有十万多个微生物存在。
它们一般都藏在土层１０厘米、２０厘米深处。
土层越深，微生物数量就越少；
但最表层的土壤由于阳光照射，水分又少，所以活的微
第六章
工业微生物筛选
目录
1. 采样 2．富集培养 3．纯种分离 4．代谢产物鉴定
第六章 第一节 采样
采样
采样的材料来源越广泛，越易获得新种。 极端环境是比较重要的采样点。 高温、低温、高压、高盐、耐酸、耐碱等环境。
高温（高温水域——水生栖热菌 ——Taq聚合酶）
耐酸（酸性热泉 ——嗜酸的氧化亚铁硫杆菌 ——pH值 低于1.5的环境 ——氧化硫和铁，并产生硫酸 ）