邻、间和对－羟基苯甲酸的荧光性质和定量分析
实验目的
1．学习荧光分析法的基本原理和操作
2．了解化合物的荧光性质及其与结构的关系
3．掌握荧光定量分析的方法
实验原理
邻-羟基苯甲酸(亦称水杨酸)、间-羟基苯甲酸和对-羟基苯甲酸分子组成相同，均含一个能发射荧光的苯环，但因其取代基的位置不同而具不同的荧光性质。

在pH 12的碱性溶液中，二者在310nm附近紫外光的激发下均会发射荧光；在pH5.5的近中性溶液中，间-和对羟基苯甲酸荧光较弱，邻-羟基苯甲酸因分子内形成氢键增加分子刚性而有较强荧光，且其荧光强度与pH 12时相同。

利用此性质，可在pH 5.5时测定二者混合物中邻-羟基苯甲酸含量，间-羟基苯甲酸不干扰。

乙酰基水杨酸（阿司匹林）可以在碱性溶液中迅速水解，呈现水杨酸的荧光性质，因此可用荧光法进行定量分析。

仪器与试剂
仪器：日立F4500型荧光分光光度计，其基本操作参见附录。

需设定的主要仪器参数有：
带通(Bandpass)（或称狭缝）5 nm
扫描速度(Scan speed) 适中
灵敏度（纵坐标）
10mL比色管、吸量管。

试剂：邻-羟基、间-羟基和对-羟基苯甲酸储备液：1 10-3mol/L (水溶液); HAc—NaAc缓冲溶液：47gNaAc和6g冰醋酸溶于水并稀释至1L，得pH 5.5的
缓冲液；
NaOH水溶液：0.01mol/L。

HCl水溶液：0.1mol/L
硫酸奎宁溶液：5⨯10-5mol/L（0.1mol/L硫酸溶液）
实验内容与步骤
1．pH对荧光光谱的影响
配制三种化合物的标准溶液浓度约为1⨯10-6mol/L，pH分别为1.0，5.5和12的溶液，扫描荧光光谱。

测定荧光激发光谱和发射光谱：先固定发射波长为400nm，在250～350nm 区间进行激发波长扫描，获得溶液的激发光谱和荧光最大激发波长；再固定激发波长，在350～500nm区间进行发射波长扫描，获得溶液的发射光谱和荧光最大发射波长。

此时，在激发光谱最大激发波长处和发射光谱最大发射波长处的荧光强度应基本相同。

2. 水杨酸的分析特性（分析专业学生选做）
根据上述激发光谱和发射光谱扫描结果，确定一组波长(最大激发和发射波长)，最佳酸度条件，测定水杨酸的线性范围和检出限（S/N=3）
(1)线性范围：配制浓度在1⨯10-7mol/L-5⨯10-5mol/L水杨酸标准系列（5个点）于已编号的10mL比色管中，各加入1.0mL pH 5.5 HAc-NaAc缓冲液（或选择的其它缓冲溶液），用去离子水稀释至刻度，测定荧光强度，绘制标准曲线。

(2) LOD测定：配制相应的空白溶液，测定荧光强度，平行5份，根据空白值计算标准偏差和相应的LOD。

配制浓度为2倍于计算出的检出限的标准溶液，扫描光谱，进行验证。

数据处理
(1) 根据不同pH下，三种化合物的荧光光谱总结其荧光性质，pH影响规律并分析原因
(2) 制作标准曲线，线性方程和线性相关系数
(3) 计算LOD，报告中应附上低浓度荧光光谱
3. 相对法测定水杨酸的量子产率（物化和无机专业学生选做）
在水杨酸发射荧光最佳条件下，以硫酸奎宁（量子产率查表）为参比物质，测定
水杨酸的荧光量子产率，本法只适用于液体样品。

荧光量子产率：abs
em nr f f
photons photons k k k Q =+=∑ 式中Q 为量子产率，k f 荧光发射速率常数，k nr 为非辐射跃迁速率常数 相对法测定荧光量子产率：22R
s R s R s n n m m Q Q = 式中R 表示参比物质，m 为荧光发射光谱面积对相应的吸光度所做直线的斜率，n 为溶液的折射率（如果参比物质和样品用同样的溶剂则为1）。

量子产率也可以用单点法测定，但是测量误差会比较大。

参比物质的荧光激发波长应与待测物质相同或接近，本实验中先扫描硫酸奎宁的荧光激发和发射光谱，找出其最大激发波长，激发波长应与水杨酸接近。

测定方法：
（1）校正荧光仪的激发和发射波长强度：激发波长校正用罗丹明B 溶液（5g/L ），校正发射波长用散射光池；
（2）配制3-5种不同浓度的硫酸奎宁溶液和水杨酸溶液（最佳条件）使其吸光度（最佳激发波长下）在0.01, 0.03,0.05左右（浓度最大溶液的吸光度必须在0.1以下），本实验配制3个不同浓度；
（3）测定硫酸奎宁和水杨酸溶液的吸光度（波长设置为二者的激发波长）；测定溶剂空白的吸光度，
（4）扫描硫酸奎宁和水杨酸溶液的荧光光谱，测定荧光发射光谱的面积，测定溶剂空白的荧光光谱，测定相应波长范围的面积；
（5）以吸光度为横坐标，荧光面积为纵坐标，绘制分别两种化合物的吸光度与荧光发射面积（必须扣除空白）的相关关系，得到线性方程和线性相关系数，如下图,线性相关系数应至少为0.99；
示例：吸光度和荧光光谱面积的线性相关关系
（6）将所得斜率带入计算方程，查出溶剂的折光率，计算荧光量子产率思考题
1. pH 5.5时，邻-羟基苯甲酸(pK a1=3.00, pK a2=1
2.38)和间-羟基苯甲酸(pK a1=4.05, pK a2 =9.85), 水溶液中的主要存在的酸、碱型体是什么? 为什么二者的荧光性质不同?
2.从本实验可总结出几条影响物质荧光强度的因素?
3.如果要考查激发态的pKa值是否与基态不同，应如何设计实验？
4. 本实验测定的荧光量子产率可能不成功，试分析原因
荧光分光光度计的使用说明
一、开机前准备
1.实验室温度应保持在15℃～30℃之间，湿度应保持在45％～70％之间。

2.确认样品室内无样品后，关上样品室盖。

二、开机
1. 打开电源开关（POWER→ON）待风扇正常运转
2. 按（XeLAMP START）钮，黄色指示灯亮（按钮时间不能超过5秒）。

3. 在氙灯点亮后，打开（MAIN→ON）。

4. 开计算机及外设，点击桌面上的Flsolution软件，等待光谱仪自检，绿色指示灯亮。

三、编辑分析方法和测量
1. 点击右边菜单的Method按钮。

2. 出现一个Analysis method对话框。

3. 点击General按钮。

4. 在Measurement中可选择（波长扫描Wavelength scan；时间扫描Time scan；光度测量
Photometry；三维扫描3－D scan）。

扫描荧光光谱选择波长扫描，进行定量分析选择光度测量。

5. 点击（instrument），测量模式可选择荧光Fluorescence, 发光Luminescence 磷光
Phosphorescence，本实验选荧光。

可设定荧光激发Excitation荧光发射Emission，同步Synchronous等参数。

6. 分析方法建立后，点击OK，方法生成。

7. 点击measure，仪器开始测量。

测量完成后出现图谱处理图标，可选择相应的功能，如荧
光光谱面积积分等。

四、生成报告，保存文件
1.用Excel格式保存数据，点击Report,自动生成的文件选择文件——副本另存为——重命名
保存在指定文件夹。

2.关掉图谱窗口，系统提示保存图谱文件，设置文件名，保存。

五、关机
1. 拿出样品池中样品，退出软件所显示的所有窗口，关掉电脑。

2. 关闭（Main→OFF）。

注：不关氙灯。

3. 关闭电源。

4. 打开电源开关（POWER→ON）风扇正常运转，排氙灯热量，直至排风处吹冷风为止（约
15分钟左右）。

5. 在记录本上记录使用情况。

注意事项: 开机，关机顺序千万不能搞错。