文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持.201x-xx-xx发布201x-xx-xx实施食品安全国家标准食品中低聚半乳糖的测定（征求意见稿）食品安全国家标准食品中低聚半乳糖的测定1 范围本标准规定了离子色谱法测定食品中低聚半乳糖的方法。
本标准适用于婴幼儿食品、乳制品、焙烤食品、糖果、饮料、醋、糖浆、糖粉等食品中低聚半乳糖的测定。
不适用于产品中乳糖含量与低聚半乳糖含量比值大于6 的产品。
2 原理样品用磷酸盐缓冲液提取，用β-半乳糖苷酶水解。
采用离子色谱分别测定初始提取溶液和酶解后的提取溶液中的乳糖和半乳糖。
用酶解后的半乳糖含量减去酶解前的半乳糖含量和乳糖酶解产生的半乳糖含量，计算出样品中低聚半乳糖的含量。
3试剂和材料3.1 试剂注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1.1α-淀粉酶：酶活力≥1.5 U/mg。
3.1.2β-半乳糖苷酶：来源于米曲霉，酶活力≥8 U/mg。
3.1.3 磷酸二氢钾（KH2PO4）。
3.1.4 磷酸氢二钾三水合物（K2HPO4·3H2O）。
3.1.5 氢氧化钠：色谱纯。
3.1.6 无水醋酸钠（CH3COONa）：色谱纯。
3.1.7 乙醇（C2H5OH）。
3.1.8 乙腈（C2H3N）。
3.2 试剂配制3.2.1 磷酸盐缓冲溶液（0.2 mol/L pH 6.0）：称取22.0 g磷酸二氢钾和6.0 g磷酸氢二钾三水合物，加水溶解并稀释至1L。
120℃高压灭菌器中灭菌30 min。
3.2.2 β-半乳糖苷酶溶液（500 U/mL）：称取活性约为5000 U的β-半乳糖苷酶溶于10 mL磷酸盐缓冲溶液中，制成最终活性为500 U/mL的β-半乳糖苷酶溶液，用时现配。
3.2.3 乙醇溶液（50%，V/V）：量取500 mL乙醇加水稀释至1 L。
3.2.4 乙腈溶液（20%，V/V）：量取200 mL乙腈加水稀释至1 L。
3.2.5 氢氧化钠溶液（50%）：称取100 g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100 mL。
涡旋混合均匀，静置至碳酸钠沉淀，上层液体澄清待用（约需10天），不用时密封。
或市售相当试剂。
3.3 标准物质3.3.1 半乳糖标准物质（C6H12O6）：纯度≥98%。
3.3.2无水乳糖标准物质（C12H22O11）：纯度≥98%。
3.4标准溶液配制3.4.1 半乳糖贮备液（1.0 mg/mL）：准确称取适量半乳糖标准物质，用水溶解，配制1.0 mg/mL的半乳糖贮备液，保存于4℃冰箱，可使用1个月。
3.4.2乳糖贮备液（1.0 mg/mL）：准确称取适量乳糖标准物质，用水溶解，配制1.0 mg/mL的乳糖贮备液，保存于4℃冰箱，可使用1个月。
3.4.3 标准曲线工作液：分别取适量半乳糖和乳糖贮备液，用水逐级稀释成浓度为1 µg/mL、5 µg/mL、10 µg/mL、20 µg/mL、25 µg/mL半乳糖和乳糖混合标准曲线工作液，用时现配。
4 仪器和设备4.1 离子色谱仪：配有三元及以上梯度泵，脉冲安培检测器，金工作电极。
4.2 天平：感量为0.1 mg和0.01 g。
4.3 pH计：精度为0.02 pH单位。
4.4 涡旋混合器。
4.5 水浴振荡器：40 ℃~ 100 ℃。
4.6 粉碎机4.7 离心机：转速≥5000 r/min。
5 分析步骤5.1试样制备5.1.1 试样预处理块状或颗粒状样品：取有代表性的样品至少200 g，用粉碎机粉碎，置于密闭的容器内。
粉末状、糊状或液体样品：取有代表性的样品至少200 g，充分混匀，置于密闭的容器内。
5.1.2 试样提取婴幼儿食品、焙烤食品、乳粉：称取均匀样品5 g（精确到0.01g）于50 mL刻度离心管中，加入0.5 g α-淀粉酶，加入40 mL水溶解，混匀。
在60℃±5℃水浴中持续振摇30 min，冷却至室温后用水定容至50 mL，必要时加入1滴~ 3滴乙醇消泡。
液态奶：称取均匀样品25 g（精确到0.01g）于50 mL刻度离心管中，加入20 mL水溶解，混匀。
在60℃±5℃水浴中持续振摇30 min，冷却至室温后用水定容至50 mL，必要时加入1滴~ 3滴乙醇消泡。
饮料、醋、糖果：称取均匀样品2.5 g（精确到0.01g）于50mL刻度离心管中，加入20 mL水溶解，混匀，用水定容至50 mL。
糖浆、糖粉：称取均匀样品0.5 g（精确到0.01g）于50mL刻度离心管中，加入20 mL水溶解，混匀，用水定容至50 mL。
5.1.3 提取液酶解移取5.0 mL试样溶液（mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲溶液定容至50 mL，备用。
移取提取液（mL于10 mL刻度离心管中，加入0.5 mL β-半乳糖苷酶溶液，混匀，在60℃±5℃水浴中持续振摇60 min，冷却至室温后用20%乙腈定容至10 mL。
溶液摇匀，10000 r/min离心10 min，上层水相用滤纸过滤，滤液按附录A中样品中低聚半乳糖含量范围稀释因子的指导值用水稀释，稀释液用0.22 µm滤膜过滤，用于测定酶解后半乳糖的浓度（C1）。
同时提取液（ mL 于10 mL 刻度离心管中，加入0.5 mL 磷酸盐缓冲溶液，混匀，在60℃±5℃水浴中持续振摇60 min ，冷却至室温后用20%乙腈定容至10 mL 。
溶液摇匀，10000 r/min 离心10 min ，上层水相用滤纸过滤，滤液按附录A 中样品中乳糖含量范围稀释因子的指导值用水稀释，稀释液用0.22 µm 滤膜过滤，用于测定初始提取溶液中游离乳糖的浓度（C 2）。
滤液按附录A 中样品中半乳糖含量范围稀释因子的指导值用水稀释，稀释液用0.22 µm 滤膜过滤，用于测定初始提取溶液中游离半乳糖的浓度（C 3）。
5.2 仪器参考条件5.2.1 色谱柱：CarboPac PA-20（150 mm ×3 mm （内径），粒径 3.5 µm ）。
注:方法中所列色谱柱仅供参考,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可。
如果其他 色谱柱能有相同的效果,则可使用这些等效的色谱柱5.2.2 淋洗液淋洗液A （去离子水）：量取2 L 去离子水，超声脱气15 min ，避免振摇，使用前再脱气30 min 。
淋洗液B （250 mmol/L 氢氧化钠溶液）：量取1 L 去离子水，再移入50%氢氧化钠溶液（ mL ，使用前脱气30 min 。
淋洗液C （100 mmol/L 氢氧化钠溶液，含400 mmol/L 醋酸钠）：称取32.8 g 无水醋酸钠（，用1 L 去离子水将其溶解，0.22 µm 滤膜过滤，再移入50%氢氧化钠溶液（ mL ，使用前脱气30 min 。
淋洗液流速：0.45 mL/min 或与对应色谱柱相匹配，淋洗液洗脱梯度程序见附录B.1。
5.2.3 检测器：脉冲安培检测器，金工作电极，Ag/AgCl 参比电极，糖四电位波形，检测器时间程序见附录B.2。
5.2.4 柱温：30℃。
5.2.5 进样体积：10 µL 。
5.3 标准工作曲线的制作将标准系列工作液从低到高分别注入离子色谱仪中，测定相应的信号响应值（峰面积），以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
标准溶液色谱图参见附录C 。
5.4 测定将试样溶液C 1、C 2和C 3溶液注入离子色谱仪中，得到相应的乳糖和半乳糖信号响应值（峰面积），根据标准曲线得到待测液中半乳糖和乳糖的浓度，平行测定次数不少于两次。
注：可能有的干扰：半乳糖是估计产品中低聚半乳糖含量的最重要的参数。
供试品如含有高浓度的乳糖，会影响从低聚半乳糖中释放的半乳糖的测定。
α-半乳糖苷（如角豆荚粉）被半乳糖苷酶的非选择性水解也会发生，产生错误的结果，只能使用新鲜酶制备。
6 分析结果的表述样品中低聚半乳糖含量x 按公式（1）计算，数值以g/kg 表示。
)9.1(35.1x b bt G L G --⨯= …………………………………………（1） 式中：x ——样品中低聚半乳糖含量，单位为克每千克（g/kg ）； 1.35——折算系数因子；注：1.35为低聚半乳糖原料的k 值，若能确认产品添加的低聚半乳糖来源，可使用实测k 值作为计算值。
G t ——酶解液中最终的半乳糖含量，单位为克每千克（g/kg ）； L b ——初始提取液中的乳糖含量，单位为克每千克（g/kg ）； 1.9——乳糖折算成半乳糖的折算系数；G b ——初始提取液中的半乳糖含量，单位为克每千克（g/kg ）。
其中： G t 按公式（2）计算： 1000m 11⨯⨯⨯=F V C G t (2)L b 按公式（3）计算：1000m 22⨯⨯⨯=F V C L b (3)G b 按公式（4）计算：1000m 33⨯⨯⨯=F V C G b (4)式中：G t ——酶解液中最终的半乳糖含量，单位为克每千克（g/kg ）； C 1——酶解液中最终的半乳糖的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL ）； L b ——初始提取液中的乳糖含量，单位为克每千克（g/kg ）； C 2——初始提取液中的乳糖的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL ）； G b ——初始提取液中的半乳糖含量，单位为克每千克（g/kg ）； C 3——初始提取液中的半乳糖的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL ）； m ——样品称样量，单位为克（g ）；V ——样品处理过程稀释体积，单位为毫升（mL ）； F 1、F 2、F 3——稀释因子指导值； 1000——单位转换系数。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字。
7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
8 其他方法的定量限为：乳粉为50.0 g/kg ，婴幼儿食品、焙烤食品为3.50 g/kg ，液态奶、糖果、饮料、醋为10.0 g/kg ，糖浆、糖粉为20.0 g/kg 。
附录 A样品稀释因子指导值表A.1给出了样品稀释因子指导值附录 B淋洗液洗脱梯度程序和检测器时间程序B.1 淋洗液洗脱梯度程序B.2 检测器时间程序表B.2 检测器时间程序附录 C标准溶液色谱图图C.1给出了标准溶液色谱图图C.1 半乳糖、乳糖标准溶液混合色谱图附录 D 酶活力测定D.1 α-淀粉酶的活力测定方法参照GB 8275-2009《α-淀粉酶制剂》中酶活力测定方法。
D.2 β-半乳糖苷酶活力测定方法 D.2.1 原理在30℃，pH 4.5条件下，每分钟催化生成1 μmol 产物邻硝基苯酚（ONP ）所需的酶量定义为1个酶活力单位。