制药工艺学实验制药工程11级预习思考题：1 查阅文献简述放线菌的形态特征？2 土壤稀释时，移液管尖端为什么不能接触下一只试管的液面？3 土壤前处理的目的是什么？实验一土壤中放线菌的筛选一、目的要求1、学习从自然界中分离微生物的基本原理与方法2、掌握放线菌形态的基本特征3、通过这个综合实验，全面复习与掌握微生物学中的一些基本实验操作，特别是无菌操作技术。

二、基本原理土壤中含有丰富的放线菌，但主要是链霉菌，链霉菌以外的其他放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。

但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离方法很难得到。

对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾的方法减少细菌和真菌的数量；可以分离得到更多种类的放线菌。

放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌，它是一种严格好气性的微生物，具有一定的腐生性，因此在采土样时选择干燥和腐蚀性较强的地点，去除表层的土壤。

三、实验材料1 材料：超净工作台、酒精灯、土样，培养皿，试管，移液管，接种环，放线菌分离平板，涂布棒、恒温箱等。

2 试剂可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、琼脂粉、苯酚。

蔗糖、葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏、pH试纸、棉线、纱布等。

四、实验准备工作1、土样采集取土壤表层以下5-10cm 处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。

2、无菌水的制备及装有玻璃珠的45mL的无菌水。

3、移液管、培养皿、锥形瓶等的清洗、包扎与灭菌按以前的实验操作，将实验所需用到的移液管、培养皿进行清洗、包扎与灭菌。

每组1mL 4只、10mL 1只、培养皿10套、试管3只。

4、放线菌分离培养基的配制与灭菌及平板、斜面的制备高氏一号固体培养基：可溶性淀粉 20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂粉15g，水1000mL，pH7.4～7.6。

每组150mL 1瓶。

高氏一号液体培养基：配方同上，不加琼脂粉。

每组50mL3瓶。

按以前的实验操作，将培养基分装入三角瓶或试管内，包扎，然后进行高压蒸汽灭菌，冷却后倒平板或摆斜面待用。

五、实验实验方法与步骤1、土样风干：将采集的土样，在一玻璃平盘中平铺，自然风干5d左右，此举可大幅度减少细菌数量和种类。

2、土样烘干：用玻棒将干土样碾碎过筛， 100℃烘烤1小时。

3、土样稀释：称取10g土样加入90mL灭过菌的无菌水的三角瓶中，加入0.5mL的苯酚，室温下振荡30分钟，静置5min后，取上清液用无菌水稀释20倍。

每次进行20倍梯度稀释。

4、放线菌的分离：分别取400倍、8000倍土壤稀释液各0.2mL 涂布于分离培养基，每个稀释梯度各涂布2皿，28℃培养3~7d。

5、挑取单个菌落置于另外一块新的培养基中，直至纯化为止。

6、纯菌落调至高氏一号斜面培养基中保藏。

7、放线菌菌落形态观察观察所纯化的菌落的大小、表面的形状（崎岖，褶皱或平滑）、气生菌丝形态（绒状，粉状或茸毛状），有无同心环，菌落颜色等。

六、实验报告1、将分离到的放线菌纯培养物，加以编号，分别对其个体形态和菌落形态进行描述，上交给指导教师。

2、如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？请写出简明的实验方案（提示：产蛋白酶菌株在酪素平板上形成降解酪素的透明圈）。

3、如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做？预习思考题：1 如何保证您在实验中的抑菌圈是由放线菌菌株产生的？2 查阅资料，您认为哪些因素会影响抑菌圈的大小？实验二土壤中放线菌代谢物药理活性的筛选一、目的要求1、抗生素产生菌体外筛选原理2、抗生素产生菌体外筛选方法3、抗生素产生菌的发酵二、基本原理从土壤中分离所得菌株能否产生有实用价值抗生素也必须经过一系列筛选和测定，在琼脂平板上测定这些菌株代谢产物在植物体外抗菌活性是最常用的一种手段。

一般来说，抗生素筛选工作可以直接用植物某些病原菌作为筛选模型。

体外抑菌试验结果在有抗菌活性的抗生菌菌落周围，往往出现明显抑菌圈。

根据抑菌圈大小、透明度、边缘整齐与否来判断该菌株抗菌活性强弱，一般选留抑菌圈大、透明且边缘整齐菌株作进一步的研究。

三、实验材料培养皿，试管，移液管，接种环，铁架台，恒温箱，显微镜、纱布、滤纸、玻璃珠、灭菌锅、超净台等。

可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、琼脂、土豆、牛肉膏、蛋白胨、蔗糖、葡萄糖、牛肉膏、pH试纸等。

供试微生物：大肠杆菌、黑曲霉、金黄色葡萄球菌。

四、实验准备工作1、放线菌活性测定培养基的配制PDA 培养基：马铃薯去皮切片煮烂约30分钟，四层纱布过滤，按配方称取试剂药品，加水至1000mL，pH自然。

每组100mL 2瓶。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL；调节pH=7.2～7.4。

每组150mL 1瓶。

2、装有玻璃珠的50mL的无菌水3瓶（实验老师准备）。

3、移液管、培养皿等的清洗、包扎与灭菌按以前的实验操作，将实验所需用到的移液管、培养皿进行清洗、包扎与灭菌。

每组1mL 3只、培养皿上次用过的未灭菌的。

五、实验实验方法与步骤1 供试菌菌悬液的制备2 混菌平板制备3 抑菌实验将实验一得到的链霉菌通过琼脂柱移块法分别在三种供试平板上测定有无抑菌圈。

具体操作为：链霉菌在高氏一号培养基中28℃培养3天、供试菌涂布平板（四种菌分别取0.2mL 至培养基中）；通过接种铲移至大肠杆菌、金黄色葡萄球菌（牛肉膏蛋白胨培养基）、黑曲霉（PDA）。

培养24h，检查有无抑菌圈的出现。

（每组做三种菌）4 实验结果（抑菌实验）你在本次试验中共分离得到几株具有抑菌活性的放线菌？并记录抑菌能力。

抑菌圈直径（单位mm）菌株编号大肠杆菌金黄色葡萄球菌黑曲霉12345注：无用“-”表示预习思考题：1 为什么要制备种子培养基，而不是直接接种微生物于发酵培养基中？2 对于具有一定生理活性物质的菌株，您认为哪些因素会影响其代谢产物的含量？3 发酵过程中如何尽量减少染菌？实验三土壤中活性放线菌发酵一、目的要求1、发酵优化原理2、发酵优化方法3、活性菌株发酵的一般工艺流程二、基本原理培养基成份和配比合适与否，对产生菌的生长发育、抗生素的生物合成、提炼工艺及最后抗生素的产量、质量都产生相当大的影响。

培养基的成份主要有碳源、氮源、无机盐、微量元素、维生素、生长素、促进剂及前体等。

碳源是用来供给产生菌生命活动所需要的能量和合成菌体细胞以及各种代谢产物的物质基础，生产上须选用合适的碳源，作为培养基主要组成，进行工业规模的发酵。

氮源主要用来构成菌体蛋白质和核酸以及各种含氧有机物，主要分成有机氮和无机氮二种。

有机氮源除含有丰富的蛋白质、胨、多肽和游离氨基酸外，还含有少量核酸、糖类、无机盐和生长素，是微生物的理想营养物质。

而无机氮主要是作为辅助氮源，其中氨氮和尿素是最容易被吸收利用的。

良好的培养基配比可以充分发挥生产菌种的生物合成能力，使之达到最大的生产效果。

所以要搞好抗生素发酵，必须摸清培养基的组成和配比，然后再随着生产的需要不断深入，不断调整。

提高发酵水平的另一个重要途径是选择合适的发酵条件，包括温度、种龄、接种量、初始 pH 值、发酵时间和溶解氧等因素。

例如温度对抗生素发酵的影响是多方面的，除了直接影响发酵过程中各种酶促反应速率外，还会影响氧在发酵液中的溶解度和传递速率，此外温度还影响抗生素合成的方向。

因此在降低抗生素的生产成本，提高市场竞争力上，发酵条件的研究与菌种选育一样有作非常重要的作用。

本研究主要对实验2分离得到的链霉菌菌株产抗生素发酵培养基及其发酵条件优化，同时为实验4分离纯化抗生素，进一步明确抗生素种类、类型及理化性质，为以后工业生产奠定基础。

三、实验材料3.1 菌种抗生素产生菌、大肠杆菌、黑曲霉、金黄色葡萄球菌。

3.2 主要仪器设备摇床、电子天平、超净工作台、灭菌锅、显微镜、锥形瓶。

3.3 实验耗材可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、KH2PO4·、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、葡萄糖、黄豆粉、玉米粉、琼脂、土豆、牛肉膏、蛋白胨、蔗糖、葡萄糖、牛肉膏、pH 试纸等。

四、实验方法4.1 种子培养基的配制配方：蛋白胨20g/L，葡萄糖10 g/L，硫酸镁2g/L，磷酸二氢钾2g/L；pH=7。

（每组100mL）4.2 优化培养基的配制配方1：可溶性淀粉 20g/L， KNO3 1.0g/L， MgSO4.7H2O 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4.7H2O 0.01g/L；pH=7。

（每组100mL，分装为2瓶，即50mL/瓶）配方2：大豆粉14g/L，淀粉14 g/L，氯化钠10g/L，磷酸二氢钾2.4g/L，硫酸镁2.4g/L；pH=7。

（每组100mL）上述三种配制好后121℃灭菌30min后备用。

4.3 种子制备从斜面刮取孢子接种到基础培养基中，于摇床上28℃、转速为150RPM发酵两天，以下均同。

4.4 发酵由发酵两天后的种子发酵液接种至发酵培养基中，每瓶接种2mL后于摇床上28℃、转速为150RPM发酵四天。

4.5 抗生素的生物活性测定混菌平板制备同实验2，采用牛津杯法进行生物检测，每个牛津杯加入发酵液200μL，72h 后测定抑菌圈大小。

五、实验结果放线菌活性测定结果记录于下表中。

比较两配方对代谢产物积累的影响。

抑菌圈直径（单位mm）培养基大肠杆菌金黄色葡萄球菌黑曲霉配方1配方2预习思考题：1 查阅文献资料，微生物代谢产物提取的一般工艺流程？2 发酵液为什么不能采用高温煮沸法去除其水分？3 提取之前，为什么要弄清楚发酵液的理化性质？实验四土壤中放线菌代谢物提取一、目的要求1、特定活性物质理化性质分析方法2、活性物质提取原理和方法二、基本原理对发酵液中的活性物质进行了有机溶剂萃取研究。

在菌丝体同样也存在着活性物质，而采用了超声波法浸提。

一般来讲抗生素的分离、纯化方法包括以下4个阶段:(1)发酵液的预处理和固液分离；(2)抗生素的提取—粗品的获得；(3)抗生素的精制。

发酵液的预处理和固液分离是抗生素提取的第一步。

预处理的主要目的是将发酵液中残余菌丝体、杂蛋白以及其它杂质去除和改变滤液性质以利于抗生素的提取。

对于发酵液中高价无机离子主要是通过加入其它试剂使其形成不溶性的沉淀和络合物而除去。