基因诊断是第四代实验室诊断技术，直接以病 基因诊断是第四代实验室诊断技术，直接以病 理基因为对象， 理基因为对象，属病因学诊断 为对象 前三代分别为细胞学 生化指标、 前三代分别为细胞学、生化指标、免疫学 细胞学、 共同点： 共同点：以疾病的表型改变为诊断依据 由于表型改变通常在病程的中晚期才出现 （且很多情况下不是特异的），故不能解决早 且很多情况下不是特异的），故不能解决早 ）， 诊、早治的需求
成年型多囊肾病的连锁分析诊断
Ⅰ ●─┬─□ ─┬─□ 1 │ 2 └────┬───┬───┬───┬───┐ ● ■ ○ 1 2 3 kb 5.7 3.4 ━ 2.4 ━ ━ ━ ━ ━ ━ ━ ━ ━
Ⅱ
□ 4 ━ ━
◇？ 5 ━ ━
3’HVR作为探针、PvuII酶切 3’HVR作为探针、PvuII酶切 作为探针
特点： 特点：
1、不需了解致病基因结构，适用于大多数由未 不需了解致病基因结构，
知基因缺陷或致病基因已知但异常未知所引起的 遗传病的诊断 家系收集繁琐、常由于家系不够完整、 2、家系收集繁琐、常由于家系不够完整、标记 与致病基因重组、标记杂合度有限而难以完成 与致病基因重组、
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
连锁： 连锁：指同一条染色体上位置相邻的基因或
主要用于检测样本中是否含有目的序列 或序列有无改变
Southern 杂交的应用
举例： 举例：α地贫的基因诊断
αα/αα αα/-- αα/α- α-/-- --/-αα/-- αα/α--/
10kb
4kb
┌─────────────┐ │ ── │ ── ── ── ── │ 14kb │ 10kb
exon bp N P │ Pro 535 ━━ ━━ │ │ 3 410 ━━ ━━ │ 43 357 ━━ ← │ │ 50 271 ━━ ━━ │ 13 238 ━━ ━━ │ │ 6 202 ━━ ━━ │ 47 181 ━━ ━━ │ │ 60 139 ━━ ━━ │ 52 113 ━━ ━━ └────────────┘ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
测；检测碱基跨度小
方法的改进： PCR－ASO技术 PCR－
先将含有突变点的基因待测片段进行扩增， 先将含有突变点的基因待测片段进行扩增，再与ASO探针 作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间， 作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要 极少量的基因组DNA就可进行
正常探针 GAG
点杂交
直接基因诊断
概念：直接检测致病基因本身的结构性改变（ 概念：直接检测致病基因本身的结构性改变（如单
个碱基的缺失、插入、置换；片段的缺失、易位、 个碱基的缺失、插入、置换；片段的缺失、易位、重 复以及动态突变等） 复以及动态突变等）
适用范围：致病基因序列已知且基因结构异常已知 序列已知且基因 适用范围：致病基因序列已知且基因结构异常已知
┴──────┴───┴─ α ↑BamHI α 5'────□ 5'────□──── 3'(α) ↑ 5'─ ─ ─ ─ ↑ ─ ─ ─ α
└─────────────┘ ↑BamHI
5’───□──□───── 3’ ───□──□ 3’
3'(-3'(--) --)
杜氏/ 杜氏/贝氏进行性肌营养不良的缺失诊断
致并只能与之稳定地杂交；另一种与突变基因序列一致且只 致并只能与之稳定地杂交；另一种与突变基因序列一致且只 能与突变基因序列稳定杂交。通过点杂交， 能与突变基因序列稳定杂交。通过点杂交，就可以把只有一 个碱基发生了突变的基因区别开来
特点：特异性、灵敏度非常高；但杂交费时，不利于快速检 特异性、灵敏度非常高；但杂交费时，
基因治疗的策略
致病基因的原位矫正或置换 基因的异位替代 直接抑制有害基因的表达 增强机体免疫能力
基因治疗的技术流程
选择治疗性基因 选择靶细胞 选择基因载体 基因转移 筛选表达的外源基因 回输体内
基因治疗需解决的问题
寻找真正有治疗作用的基因 搞清外源基因在人体内的表达调控 构建安全有效的可控载体 研究体细胞移植和重建的生物学 避免外源基因对机体的不利影响
┴──────┴───┴─ α ↑BamHI α 5'────□ 5'────□──── 3'(α) ↑ 5'─ ─ ─ ─ ↑ ─ ─ ─ α
└─────────────┘ ↑BamHI
5’───□──□ 5’───□──□───── 3’
3'(-3'(--) --)
等位基因特异性寡核苷酸杂交
的遗传病的诊断
特点： 特点：
1、不必收集家系标本、方法简单、可靠（首选方法） 不必收集家系标本、方法简单、可靠（首选方法） 2、由于遗传异质性的原因，以及多数遗传病的基因 由于遗传异质性的原因，
异常尚属未知，故目前能直接诊断的病种虽日益增多， 异常尚属未知，故目前能直接诊断的病种虽日益增多， 但仍然比较有限
基因诊断采用核酸分子杂交、PCR扩增、 扩增、 基因诊断采用核酸分子杂交、
DNA测序等灵敏度高、特异性强的分子生 测序等灵敏度高 特异性强的分子生 灵敏度高、
物学技术，可从人类庞大的基因组中检测 物学技术， 到单拷贝基因，甚至单个碱基的改变 单拷贝基因，甚至单个碱基 单个碱基的改变
遗传病
1、基因及异常已知、2、基因已知但异常未知、 基因及异常已知、 基因已知但异常未知、 3、基因未知的遗传病
• 疾病的预测
遗传性疾病的预测：产前诊断、植入前诊断、携 遗传性疾病的预测：产前诊断、植入前诊断、 带者筛查 获得性疾病的预测
•
个体识别、 个体识别、亲子鉴定
基因缺失型遗传病的诊断
α地贫的基因诊断
αα/αα αα/-- αα/α- α-/-- --/-αα/-- αα/α--/
10kb
4kb
┌─────────────┐ │ ── │ ── ── ── ── │ 14kb │ 10kb
产前诊断 、症状前诊断、现症病人诊断 症状前诊断、 肿瘤 感染性疾病： 感染性疾病：定性和定量检测病原菌或病毒 法医学鉴定：亲子鉴定、 法医学鉴定：亲子鉴定、DNA指纹
基因诊断针对的是被检测的致病基因； 基因诊断针对的是被检测的致病基因； 针对的是被检测的致病基因 基因是否处于表达状态并不重要。因此， 基因是否处于表达状态并不重要。因此， 取材可不局限于病变组织细胞
概念：通过对受检者及其家系进行连锁分析 连锁分析， 概念：通过对受检者及其家系进行连锁分析，以
推断受检者是否获得了带有致病基因的染色体， 推断受检者是否获得了带有致病基因的染色体， 称为间接基因诊断
间接基因诊断
适用范围：致病基因尚属未知、或致病基因已知 适用范围：致病基因尚属未知、
但异常未知的遗传病诊断
基因治疗的必要条件
发病机制在DNA水平上已经清楚 要转移的基因已经克隆， 要转移的基因已经克隆，其表达产物 有详尽的了解 该基因正常表达的组织可在体外进行 遗传操作
理想的基因治疗还必须
外源基因可有效导入靶细胞 外源基因能在靶细胞中长期稳定存留 导入基因能适量表达 导入基因的方法及载体对宿主细胞安 全无害
基因诊断与治疗
基因诊断
遗传因素
环境因素
性状
（疾病） 疾病）
• 基因诊断的概念：应用分子生物学方法检测受检 基因诊断的概念：
者遗传物质的结构(DNA)或表达水平 者遗传物质的结构(DNA)或表达水平(mRNA、蛋白 或表达水平(mRNA、 质)的变化而作出或辅助临床诊断的技术
• 基因诊断的内容
1、基因序列分析（定性） 基因序列分析（定性） 2、基因突变分析（定性） 基因突变分析（定性） 3、测定基因剂量和拷贝数（定量） 测定基因剂量和拷贝数（定量） 4、基因表达产物分析（定量或定性） 基因表达产物分析（定量或定性） 5、检测是否存在外源基因（定性或定量） 检测是否存在外源基因（定性或定量）
基因治疗
（gene therapy） therapy）
概念：是通过一定方式将正常基因或有治疗作用 概念： 的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基 因，从而达到治疗目的 从广义上讲， 从广义上讲，凡是采用分子生物学技术在核酸水 平上对疾病进行治疗都属于基因治疗 导入的目的基因在宿主细胞内存在方式: 导入的目的基因在宿主细胞内存在方式:整合或整 合状态 对象：体细胞、生殖细胞 对象：体细胞、
TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGC AAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG
常用检出方法：Amp-FLP、Southern blot Amp-FLP、
基因诊断的应用
• 疾病的诊断
遗传病的诊断：单基因病、 遗传病的诊断：单基因病、染色体病 肿瘤的基因诊断 获得性疾病的诊断
1990.9.14 首例基因治疗 4岁女孩 严重免疫缺陷症(SCID) --脱氧腺苷含量升 缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA) 2--脱氧腺苷含量升 高 毒性 严重破坏免疫功能 ADA基因 逆转录病毒载体 靶细胞为病人淋巴细胞 回输
基因治疗病种
单基因病、肿瘤、爱滋病、传染性疾病、神 单基因病、肿瘤、爱滋病、传染性疾病、 经系统疾病等
扩增片段长度多态性分析（Amp-FLP） Amp-FLP） ASO、PCR-ASO） 等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASO、PCR-ASO） PCR-SSCP） 单链构象多态性（PCR-SSCP） DHPLC） 变性高效液相色谱（DHPLC）
基因诊断的策略
基因诊断可根据致病基因 突变性质是否已 基因诊断可根据致病基因及突变性质是否已 致病基因及 知来制定其相应策略 基因诊断的策略 直接基因诊断 间接基因诊断
异常探针 GTG
点杂交