蛋白相互作用Pull-Down实验
实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。

是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。

Pull-Down实验可用来检测已知的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。

用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。

这个融合标签就是用于Pull-Down实验的基础。

最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His）。

其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体（如Ni2+和Co2+）。

实验准备：
实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶（镍离子琼脂糖凝胶）、离心机、
实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液
实验试剂：Binding Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、140mM NaCl、10mM KCl
SDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl(pH6.8)、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、10mM DTT
裂解缓冲液：20mM Tris-Cl(pH8.0)、200mM NaCl、1mM EDTA（pH8.0）、0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。

（蛋白酶抑制剂：2ug/ul抑肽酶（aprotinin）、1ug/ul白胃素（leupeptin）、0.7ug/ml胃酶抑素（pepstatin）、25ug/ml苯甲磺酰氟（PMSF））
实验方法：
方法一：
1、预清除细胞裂解液：
将细胞裂解液与50ul的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在4℃混合孵育2h。

离心机12,000g在4℃离心2min。

将上清转移至新的离心管中。

2、探测细胞裂解液
两个含等量预清除细胞裂解液及50ul谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。

在一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。

两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应该是等摩尔的。

将离心管在4℃翻转混合孵育2h。

最大速度在4℃离心样品2min。

在新的微量离心管中收集上清。

用1ml冰冷的裂解液洗球珠。

在离心机上以最大速度离心1ml。

弃去上清。

重复洗三次。

加入50ul 20mmol/L的还原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱GST融合蛋白及任何与其结合的蛋白质。

在离心机上最大速度离心2min。

将洗脱蛋白质与等体积的2×SDS-PAGE上样buffer混合。

3、检测相互作用蛋白质
将样品煮沸4min，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。

方法二：
1、5ug目的GST融合探针蛋白和GST蛋白分别和谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠在4℃孵育结合30min。

2、结合GST融合探针蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠与100ul细胞裂解液结合在4℃作用4h。

3、3000rpm在4℃离心5min，除去上清。

4、用洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠，3000rpm在4℃离心5min，除去上清，重复5次。

5、取谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠进行SDS-PAGE电泳分析。

方法三：
实验试剂：PBS（140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4）Elution Buffer: 50mM Tris-Cl(pH8.0)、10mM还原型谷胱甘肽
0.154g溶解到50ml 50mM Tris-Cl(pH8.0)中配制Elution Buffer。

1、细胞裂解
取1ml细菌培养液离心去上清，加200ul细胞裂解液到菌丸，在室温下重悬并轻柔的混匀。

将其在室温下晃动孵育20-30min。

2、固定GST融合蛋白到柱子上
将谷胱甘肽琼脂糖凝胶颠倒混匀后取20ul到1.5ml离心管中，小心去除上
清，加250ul Binding Buffer或wash Buffer到凝胶中，混匀。

重复洗3次以上。

平衡好的凝胶用100ul Binding Buffer或wash Buffer重悬。

加200ul含GST 融合蛋白的细菌裂解液，在旋转的台子上室温下孵育30min。

小心移去上清，（保存以便分析，）将250ul Binding Buffer或wash Buffer加到凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵育5min。

小心移去上清。

加入250ulBinding Buffer或Washing Buffer再次清洗，将凝胶用20ul Binding Buffer或wash Buffer 重悬。

3、捕获猎物蛋白
将5ul固定GST融合蛋白的凝胶中加入20ul含猎物蛋白的溶液，将155ul Binding Buffer或wash Buffer和20ul 10%BSA加入凝胶中，在室温下旋转孵育1h。

移去上清。

将400ul Binding Buffer或wash Buffer加入凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵育5min，移去上清。

加400ul Binding Buffer或wash Buffer再次清洗凝胶。

小心移去上清。

分析：加20ul SDS-PAGE loading Buffer，在室温下混合5min。

取出上清用于分析。

His Pull-Down方法
实验试剂：
Binding Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0)、150mM NaCl、20mM咪唑
Elution Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0)、300mM NaCl、500mM咪唑实验步骤：
1、结合蛋白裂解后，经0.45um滤膜过滤，
2、与Ni-NTA树脂（1ml蛋白裂解液上清结合5ul树脂）4℃混合孵育3h。

3、待树脂沉淀后用10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液洗去杂蛋白。

4、用6倍柱体积镍柱洗脱目的蛋白。

5、纯化后的蛋白用PBS和超纯水透析，冻干。

6、SDS-PAGE电泳分析
7、纯化的蛋白与Ni-NTA树脂冰浴作用2h，
8、10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤，
9、然后加入过量100ug/ml蛋白溶液，冰浴作用2h，
10、用10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗，
11、加入1倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，
12、洗脱蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。

13、阴性对照为结合蛋白溶液加入Ni-NTA树脂中冰浴作用2h。

10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗，加入1倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，
注意事项：
1、所有过柱的液体都要经过0.45um或0.22um的滤膜。

2、平衡柱子：
2.1 用3-5个柱体积蒸馏水洗柱
2.2 用3-5个柱体积的binding buffer平衡柱子。

3、洗柱：
如谷胱甘肽琼脂糖凝胶的柱子失去结合能力，需要洗去柱子上的杂质
3.1除去变性物质，用2个柱体积的的6M盐酸胍洗柱子，然后用5个柱体积
的PBS洗柱
3.2除去疏水性物质，用3-4个柱体积的70%乙醇或2个柱体积的含1%Triton
X-100的PBS洗柱，然后用5个柱体积的PBS洗柱
4、柱子的保存
用3-5个柱体积的超纯水洗柱后，用3-5个柱体积20%的乙醇洗柱后将柱子保存于4℃冰箱
5、Ni离子柱的洗柱程序和柱子的保存同带His标签融合蛋白纯化的步骤。