脉冲流加复性：分批次加入到缓冲液中，使折叠 中间体保持在较低的水平。例：在5-10mg/mL终浓
度下，溶菌酶复性收率可达80%以上。
2.透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低 外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不 适合大规模操作，无法应用到生产规模。
3. 超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允许 变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的 使用，规模较大，缺点是不适合样品量较少的情 况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性 （蛋白聚集于膜上）。
4.还原剂：由于蛋白间二硫键的存在，在增溶 时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是 50-100mM DTT，也有使用5mM浓度。实际， 还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关， 而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响。 对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶， 有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二 硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。
包涵体的溶解
1.采用高浓度的变性剂，使其形成伸展的 肽链。常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍 （GdnHCl 6-8M），通过离子间的相互作用， 破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。尿素的 增溶效果稍差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。
变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性的环 境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定。有些蛋 白只能用盐酸胍。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在 37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。
复性目的
复性：通过缓慢去除变性剂（避免折叠中 间体重新聚集）使目标蛋白从变性的完全伸展 状态（？）恢复到正常的折叠结构，同时去除 还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度 4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。 对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时 复性过程已经结束。
蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键 和最复杂的问题。蛋白质的性质不同，所处 的环境不同，使其复性条件大不相同。任何 一个蛋白质都有一个最佳的复性条件，只有 选择到了合适的复性缓冲液，使蛋白得以正 确折叠，才能使进一步的层析分离得以顺利 完成。
含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇等。加入金属螯合 剂EDTA去除金属离子。
蛋白质折叠的三态模型
(伸展态)U→(中间态)I→(自然态)N ↓
A（包涵体）
从中间体转变为天然态的过程比较缓慢。当 溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它 辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致 蛋白质的自发复性效率极低。
复性过程中的添加剂
低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠， 但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性或增加 折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产 率。可防止不可逆聚集体的出现。
2.去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以 破坏蛋白内的疏水键，避免蛋白形成疏水核 心，可以增溶几乎所有的蛋白。但由于SDS 无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用 （研究）。
3.极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋 白。如在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白 酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。 这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。
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包涵体表达的不利因素
Disadvantages:
1. 对表达蛋白的胞内修饰过程不了解。 2. 要求复杂和精确的复性过程 3. 复性过程的收率往往很低，经常成为放大的
瓶颈
分离纯化细菌包涵体蛋白质的基本步骤：
破碎细胞 (Disruption of cell)
↓ 分离包涵体 (Seperation of inclusion body)
Solid-Phase (or Matrix-assisted) Refolding
Solubilized IB (unfolded)
Refolding Solution-state
Refolded Bioactive
monomer
IB in E. coli
Functional Group
Aggregate
4.色谱复性：辅助手段，兼具分离。
4.1 凝胶过滤复性：除了蛋白质在胶粒中 传质和扩散外，蛋白质与介质之间并没有发生 其他作用。该法可以起到一定的抑制凝集作用， 并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢， 对有些蛋白质的复性有利。
4.2 吸附型层析复性：离子交换、疏水层析、 亲和层析和扩张床层析均属于吸附层析。其基本 复性原理是层析柱平衡后，将变性蛋白上样并吸 附在凝胶介质上，然后用清洗缓冲液洗掉未吸附 的变性剂和杂蛋白，最后用复性缓冲液将吸附的 蛋白洗脱下来，在洗脱过程中完成复性。
三、包ห้องสมุดไป่ตู้体蛋白复性方法
几个要求： ➢ 活性蛋白的回收率高 ➢ 正确的复性的产物易于与错误的折叠蛋白质
分离。 ➢ 折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品 ➢ 复性过程耗时少
复性常用方法
1.稀释复性：直接加入水或复性缓冲液，缺点 是体积增加较大，后续处理困难。
稀释蛋白浓度：浓度高则容易形成聚集体（较 低的复性收率）。有时需低于0.01mg/mL。
↓ 溶解包涵体 (Dissolve inclusion body)
↓ 蛋白质产物的构象复原等。 (Recovery of target protein conformation)
包涵体的复性前准备
洗涤：由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋 白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前 要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如 2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右、 1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂 TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
F
F
Solid-state refolding
Solid Support
Remove Denaturant
5.分子伴侣：主要包括硫氧还蛋白二硫键异构 酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折 叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集 过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复 性。
体内复性主要是在工程菌培养过程中同时加 入分子伴侣的基因进行共表达；体外复性主要是 将基因工程菌中包涵体溶解，再加入分子伴侣帮 助折叠。