表 2 不同水解方式对提取的影响 Table 2 The influence of diff erent hydrolyzing
methods on extraction
水解方式 检测质量浓度 /( mg /L)
直接提取 0. 046
PK酶水解 强酸水解
0. 107
-
2. 5 衍生化试剂的用量和衍生化条件的选择 利用 M STFA作衍生化试剂的目的是将阿托
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行衍生化并定容。 进样后所得峰面积代入回归方程 进行计算 ,所得结果如表 1所示。 由表 1可以看出 , 当 pH> 9时 ,药物以原形的形式被提取到有机溶剂 中 ,故选择 p H为 10～ 11可以保证提取完全。
表 1 pH 对提取的影响 Table 1 The inf luence of pH on extraction
刘 颖 ,孙桂进 ,张炳谦
(连云港市公安局 刑警支队 ,江 苏 连云港 222002)
摘 要: 用液 -液萃取的方法提取血液中阿托品 ,经 N-甲基 -N-(三甲基硅基 )三氟乙酰胺衍生化 ,建 立了人体血液中阿托品的气相色谱 -质谱联用测定法。 结果表明 ,阿托品质量浓度在 0. 050～ 0. 40 m g / L范围内线性关系良好 ,回归方程为 A= 4. 33× 106d+ 2. 28× 103,相关系数 V为 0. 998 3,提取 回收率达 82. 1% ～ 87. 6% ,检测限达 10μg / L。 关键词: 阿托品 ;血液 ; 气质联用法 中图分类号: O657. 63 文献标识码: A
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氯仿、异丙醇、三乙胺、氨水、盐酸等均为分析纯 ,萃 取液由氯仿、异丙醇和三乙胺按体积比 78∶ 20∶ 2 配制而成 ;蛋白酶 K( PK,美国 )。
阿托品标准品: 取硫酸阿托品对照品适量 ,用 2 m L 去离子水溶解 , 加数滴浓 氨水调节 pH= 10～ 11,用 2 m L 氯仿提取 ,分出氯仿层 ,于 60 ℃水浴上 通氮气流吹干 ,残渣备用。
验无干扰。
A— 含药血样 ; B— 空白血样 图 1 阿托品总离子流色谱 Fig. 1 The total atropine ion chromatogram
图 2 阿托品-MSTFA衍生化产物的 质谱 Fig. 2 The mass spectrum of atropine-MSTFA
2. 2 标准曲线 准确称取阿托品标准品 ,用甲醇配制质量浓度
品分子中的羟基转化为硅烷基 ,从而降低极性 ,改善 色谱行为。 由于 M ST FA试剂遇水极易分解 ,衍生 化反应要在完全隔绝水的条件下进行。 为避免少量 水对衍生化反应的影响 ,也可以加大衍生化试剂的 用量。 经过实验 ,采用 50μL衍生化试剂在 60℃反 应 30 mi n,可以保证衍生化完全 ,衍生化产物在室 温下保存 24 h ,未发生明显变化。 通过进一步实验 , 比较了阿托品衍生化前后的色谱行为 ,在给定的实 验条件下 ,保留时间没有显著变化 ,相同浓度衍生化 后的色谱峰面积比未衍生时提高了约 3倍。 2. 6 回收率及精密度试验
pH
4. 0 8. 0 9. 0 10. 0 11. 0 12. 0
质量浓度 / ( mg / L) - 0. 008 9 0. 094 0. 092 0. 086 0. 101
2. 4 水解方式的选择 由于阿托品在体内约 50% 与血浆蛋白结合 ,要
检测其浓度 ,必须将蛋白质水解 ,释放出药物 ,再进 行提取。本文以 1例阿托品中毒患者的血浆为样品 , 试验了直接提取法、酶水解法、强酸煮沸水解法对提 取的影响 ,结果如表 2所示。强酸水解因造成阿托品 本身的分解而导致无法检出 ,采用蛋白酶 K水解能 使水解完全 ,回收率较高。
称取硫酸阿托品对照品适量 ,溶于去离子水中 , 配制成相当于阿托品质量浓度为 0. 1 mg / L的工作 溶液 ,吸取 1 m L工作溶液 ,用盐酸和氨水分别调节 p H为 4. 0, 8. 0, 9. 0, 10. 0, 11. 0, 12. 0,分别加 入萃 取液 2 m L,涡旋振荡 5 mi n后离心 ,弃去上层水溶 液 ,有机层在 60℃下用氮气吹干。按“ 1. 2. 3”方法进
为 0. 05, 0. 1, 0. 2, 0. 3, 0. 4 mg / L的工作液 ,分别量 取 1 m L 工作液 ,挥干溶剂后按“ 1. 2. 3”方法进行衍 生化并定容 ,然后进样分析。 以阿托品质量浓度 (d) 为纵坐标 ,选择 m /z 为 124, 361离子作为积分离子 计算峰面积 ( A )作为横坐标 ,计算标准曲线。结果表 明 ,阿托品质量浓度在 0. 05～ 0. 4 mg / L 范围内线 性关系良好 ,回归方程为 A= 4. 33× 106d+ 2. 28× 103 ,V= 0. 998 3。 2. 3 pH对提取的影响
0. 164
82. 1
4. 6
3. 5
Hale Waihona Puke 0. 40. 350
87. 6
10. 1
8. 6
2. 7 最低检测限 在选定的试验条件下 ,当信噪比为 3时对最低
检测限进行测定 ,结果表明 ,本方法对血液中阿托品 的最低检测限为 10 μg / L。
3 结论
用拟定方法进行人体血液中阿托品的检验 ,所 得线性关系、提取回收率、精密度及最低检测限均符 合实际检测要求 ,方法灵敏、可靠。
第 13卷 第 4期 2004年 12月
淮海工学院学报 (自然科学版 ) Jo urnal o f Huaihai Institute of T echnolog y
V
o l. 13 N o. Dec. 2004
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文章编号: 1672-6685( 2004) 04-0052-03
气相色谱 -质谱联用法测定人体血液中的阿托品
Abstract: The liquid-liquid ex t ractio n met ho d i s used t o ex tract at ropi ne f ro m hum an blood a nd
the at ropi ne i s derived by N-m ethyl-N-( t rim ethyl-sil yl) trif luo roacet ami de. In thi s case, a m ethod f o r the a nalysi s o f at ropine in hum an blo od by g as chroma tog raphy-m ass spect rom etry is produced. The cali bra tio n curv e is li ner i n t he rang e o f 0. 050～ 0. 40 m g / L of at ropine w it h cor relati on co ef fici ent Vbeing 0. 998 3 a nd the reg ression equatio n bei ng A= 4. 33× 106d+ 2. 28× 103. T he ex t ractio n recov ery rat e o f at ropi ne at di ff erent co ncent ratio ns is 82. 1% ～ 87. 6% a nd the det ecti on limit is 10μg / L. Key words: a tro pine; plasma; gas ch ro mat og raphy-mass spect romet ry
2 结果与讨论
2. 1 对比试验 同时取空白血液样品和添加阿托品后质量浓度
为 0. 1 mg / L的血液样品 ,按照“ 1. 2. 3”方法进行提 取 ,在给定 GC-M S条件下进行分析 ,所得色谱如图 1所示。 对相应的峰作扫描 ,所得质谱如图 2所示。 由图可知 ,在给定的条件下 ,空白血样对阿托品的检
Determination of Atropine in Human Plasma by Gas Chromatography-mass Spectrometry
LIU Ying , SUN Gui -ji n, Z HAN G Bi ng-qia n
( Crimina l Brigade, Lia ny ung ang Public Security Bureau, Lia ny ung ang 222002, China)
气相色谱法 [ 4]、高效液相色谱法 [ 5]、电极法 [ 6～ 7]和比 色法 [8 ]等 ,国内对人体血液中微量阿托品的分析方 法研究较少。本文运用气相色谱 -质谱联用法对人体 血液中的阿托品进行了测定
1 实验部分
1. 1 仪器和试剂 V ARIAN GC-3900 / SAT U RN-2100T GC /M S
空白血液: 购自连云港本地医院。 加氟化钠抗 凝 ,添加一定量的硫酸阿托品对照品制成含药血样。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 色谱分析条件 V F-5M S毛细管气相色谱 柱 ,柱长 30 m ,内径 0. 25 m m,膜厚 0. 25 μm; 进样 口温度 290℃ ,柱温 100℃ ( 1 min) 10 ℃ /min 280℃ ( 10 mi n) ; 载气: He( 99. 999% ) ,恒流方 式 ,流量为 0. 8 m L /min,分 流比 100∶ 1; 瞬 间不分 流进 样方 式 ,瞬间不分流时间 0. 75 mi n。 1. 2. 2 GC-M S条件 EI离子源: 电压 70 eV ,扫描 范围 45～ 400,阱温 190℃ , 传输线温度 250℃ ,歧 管温度 40 ℃ ,灯丝电 流 10 μA, 扫描速率 0. 73 s / Scan( 3μScan) ,溶剂延迟 4 min。积分离子 124, 361。 1. 2. 3 样品提取及衍生化 取添加了阿托品标准 品的血液样品 1 m L ,加 p H为 8. 3的缓冲溶液 1. 0 m L和蛋白酶 K约 10 mg , 37℃水解过夜 ,取出放 冷 后用浓 氨水 调节 pH为 10～ 11, 加 入萃 取液 2 m L,涡旋振荡 5 mi n后离心 ,弃去上层水溶液 ,有机 溶剂用 p H为 10～ 11的氨水溶液 2 m L 洗涤两次。 分出有机层加质量分数为 10% 的盐酸溶液 2 m L, 涡旋振荡 5 mi n后离心 , 分出水层 ,用 浓氨水调节 pH为 10～ 11,加入萃取液 2 m L,涡旋振荡 5 min后 离心 ,弃去上层水溶液 ,有机层在 60 ℃下用氮气吹 干。 残渣以 50μL M ST F A分次转移至微型反应器 衬管内 ,密封后在 60 ℃下反应 30 min,取出放置 , 冷却后用氮气流在常温下吹干试剂 ,残渣用 30μL 甲醇定容后进样 ,进样量为 2μL。