❖ DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列 分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的 产生和发展。
❖ 重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和 DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。 这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史 上最重要的事件。限制性核酸内切酶能从特 定碱基序列位点切开DNA。1972，Boyer实 验室发现核酸内切酶EcoRI能特异识别 GAAUC序列，将DNA在这个位点切开产生 具有粘性末端的小片段。
Байду номын сангаас
❖ 他们还发现，EcoRl酶切产生的任何不 同来源的DNA片段能通过粘性末端之间 碱基互补作用而彼此“粘合”起来。
❖ 此后，大量类似于EroRl但具有独特识 别序列的核酸内切酶被陆续发现。到目 前为止，科学家已经几乎能随心所欲地 把任何DNA分子切割成一系列不连续的 片段，再利用凝胶电冰技术将这些片段 按照分子量大小逐一分开，以供下一步 研究。
5·2 DNA操作技术
❖植物基因组DNA的提取：液氮对植 物组织进行研磨－－破碎细胞。细 胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白 而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉 淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。 再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白， 得到的DNA溶液经乙醇沉淀。
❖ 材料 1·三羟甲基氨基甲烷(Tris) 2·乙二胺 四乙酸(EDTA) 3·氯化钠 4·－巯基乙醇 5·氯化钾 6·异丙醇 7·乙醇 8·琼脂糖 9·十二烷基硫酸钠(SDS) 10·EP管 11，陶 瓷研钵 12·加样枪和吸头 13·氯仿 14·酚
❖ 半个世纪以来，分子生物学研究取得了前所 未有的进步，主要有3大成就: 第一，解决了 遗传的物质基础问题－－基因的分子载体是 DNA; 第二，DNA分子的双螺旋结构模型和 半保留复制机制，解决了基因的自我复制和 世代交替问题; 第三，“中心法则”和操纵子 学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传 信息的流动与表达机制。
孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨 能力就越强。例如，20%的聚丙烯酰胺凝胶 可分离1-6bp的DNA小片段，而若要分离 1000bp的DNA片段，就要用3%的聚丙烯酰 胺凝胶。再如，2%的琼脂糖凝胶可分离 300bp的双链DNA分子，而分离大片段DNA 就要用低浓度(0.3%～1.0%)的琼脂糖凝胶。
❖ 试剂1·细胞提取液（100mmol/L Tris·HCl=50/26.8 pH8·0） (100mL分装为 10mL)， 5mmoI/L EDTA， 500mmol/L NaCl 1.25% SDS lmol/L －琉基乙醇
2·5mol/L KCl
❖ 将细胞提取液、KCl溶液及容器灭菌。新鲜 叶片，在液氮中研磨，分装在2只EP管中。 加入740L细胞提取液，充分混匀。65℃水 浴保温20min。从水浴中取出离心管，加入 20L5mol/LKCl溶液，混匀，冰浴20min。 8000r/min离心10min。将上清液转移到另 一EP管中。加等体积酚/氯仿混匀， 2000r/min离心5min，取上清。加等体积氯 仿，混匀，12000r/min，离心5min，取上 清。加入0·6～1倍体积的异丙醇(沉淀DNA)， 混匀。离心获得沉淀，70%乙醇洗3次。风 干沉淀。
❖ 在凝胶电泳中，加入适量嗅化乙锭(ethidium bromide，简称EB)染料对核酸分子进行染色，
然后将电泳标本放置在紫外光下观察，检测 灵敏快捷，DNA带中含0.05μg的微量DNA， 可以清晰地检测出来。EB能插入到DNA或 RNA分子的相邻碱基之间(图5-4)，并在 300nm波长的紫外光照射下发出荧光。把EB 直接加到凝胶介质中，染料便会与DNA分子
5·2·1 核酸的凝胶电泳
❖ 1·基本原理 生物大分子在一定pH条件下， 通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以 一定的速度移向适当的电极。分子在电场作 用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所 携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数 成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质 粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的 差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或 核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。
第五章 分子生物学研究方法
❖ 2·琼脂糖凝胶电泳 ❖ 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂
糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成 良好的电泳介质。经过化学修饰的低熔 点琼脂糖，在较低的温度下便会熔化， 常用于DNA片段的制备电泳。
❖ 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2～ 50kb之间;聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1～ 1000bp之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质
结合，却不能与凝胶相结合。这样就只有 DNA分子能吸收EB并发出荧光。在适当的染 色条件下，荧光强度与DNA片段的数量成正 比。
分子生物学研究方法
1、重组DNA技术发展史上的重大事件 2、DNA操作技术
3、基因克隆的主要载体系统 4、基因的分离与鉴定
❖ 分子生物学从20世纪中叶开始高速发展， 最主要的原因之一是基因操作和基因工 程技术的进步。基因操作：DNA的切割 和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细 胞转化、核酸序列分析、基因的人工合 成、定点突变和PCR扩增。这是分子生 物学研究的核心技术。基因工程：在体 外将核酸分子插入载体分子中，使之进 入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和 表达。
❖跨越天然物种屏障、把来自任何生 物的基因置于毫无亲缘关系的新的 寄主生物细胞之中的能力，是基因 工程技术区别于其他技术的根本特 征。本章将在回顾重组DNA技术史 上主要事件的基础上，讨论DNA操 作技术、基因克隆的常用载体系统 以及基因的分离与鉴定等3个环节。
5·1 重组DNA技术史上的重大事件
❖ 在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的 磷酸基团，呈离子化状态，DNA和RNA多核 苷酸链称为多聚阴离子，把它们放置在电场 当中，会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸 骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以 同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电 场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核 酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶 电泳技术分离DNA片段的基本原理。