G 试验和 GM 试验检测原理和临床应用首都医科大学附属北京安贞医院左大鹏G 试验和 GM 试验的检测原理和临床应用。

目前我们国际合国内都对侵袭性真菌病的诊断制订了标准，其中有权威的是欧洲癌症研究和治疗组织暨侵袭性真菌病感染协作组，我们简称叫欧洲标准所制订的一个标准。

这个标准它对侵袭性真菌病它分了三个不同的诊断层次。

一个叫确诊，一个叫临床诊断，一个叫疑诊。

我们国家的很多的专业委员会也都根据欧洲标准就结合我们国家和专业的特点制订了我们国家各个专业的诊断标准。

比如说中国侵袭性真菌感染工作组在 2010 年第 3 次修订的血液病和恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断，诊断标准和治疗原则，这第 3 次修订，第一次是 2006 ，第二次 2008 ， 2010 年是第 3 次修订了。

这应该是血液里的肿瘤病人所用的一个标准。

中华医学会器官移植学分会制订的实体器官移植患者侵袭性真菌感染的诊断和治疗指南。

这可能是实体器官移植的这个方面的诊断标准。

中华医学会儿科学会，中华医学会呼吸病学会，中华医学会急诊协会，中华妇产科学会也都根据自己的专业制订了的相应的侵袭性真菌感染的诊断和治疗指南。

这作为我们从事这些方面的医务工作者所遵循的一个标准。

那我们看不管是国内和国际现在都采用这样一种方式。

首先要看这个病人有没有宿主因素，它是不是容易发生侵袭性真菌，真菌感染的高危人群，你要是这样的，你要一个健康人这就不具备了，起码有一些原因它容易得侵袭性真菌感染要具备这样一个高危因素。

第二它有临床表现，当然包括临床症状和影像学，比如说胸片， CT ，颅片等等。

还有有微声学的检查，还有一个病理学检查，如果你只有宿主因素有临床表现我们叫做拟诊，不叫疑诊，疑似诊断。

如果说你在这两个基础上又多了一条有微生物学证据，或者是培养的，或者是非培养的技术凡是证明他有真菌性感染的这种可能性就要临床诊断，临床诊断。

如果再加上从肺的组织，从脏器的组织取出病理来确定，那叫确诊。

所以侵袭性真菌感染根据宿主因素临床表现微生物学真菌，组织病理的结果，可以把它分成为拟诊，临床诊断跟确诊三个层次。

确诊了当然就已经是确定了，治疗起来更有针对性。

临床诊断基本是确定了，大方向也没有问题。

拟诊是不能，不叫，就是说我们只能是一种预防性的治疗，或者是一种抢先的有干预的治疗，还不能说它一定有真菌感染。

比如说我们高度怀疑，高度怀疑。

不管我们前面讲了，就是你要做到临床诊断你就必须有微生物学的真菌。

在欧洲标准和我们国家各个专业把脑脊液能够找到隐球菌抗原这个阳性结果作为真菌性脑膜炎或者叫播散性真菌隐球菌病的一个确诊的依据。

这时候确诊就不需要组织学了，它只要脑脊液里面找到隐球菌的抗原就确诊。

血清的 1 、 3 β D 葡聚糖的检测我们称为 G 试验和这个曲霉菌的半乳甘露聚糖的 GM 试验，那就这个 G 试验和 GM 试验作为临床诊断侵袭性真菌病的依据。

当然它不是确诊，它是临床诊断。

我们来看这是中华内科杂志 2007 年中国，中华这个重症协会所制定的关于重症患者侵袭性真菌感染的诊断语言，它在这个微生物学检查里面它要求所有的标本应该是新鲜的，合格的，检测手段包括传统的真菌图片，培养技术以及新进的基于非培养的诊疗手段。

它具体包括了。

第一、有血液，这是无菌的。

胸腹水无菌体液，隐球菌抗原阳性。

第二，血液、胸腹水无菌体液，直接镜检，或者细胞学检查发现了除隐球菌以外的其他的真菌。

如果镜检发现隐球菌就可以确诊了。

发现其他的真菌有念珠菌、曲霉菌、毛霉菌等等有，不到确诊那叫临床诊断。

第三，在没有留置导尿管的情况下连续两次尿培养，培养是酵母菌阳性或者尿检发现有念珠菌管型，那这也算有微生物学证据。

如果导尿获得的尿样培养酵母菌阳性，当然它包括一个菌的计数。

第五就更换尿管前后的两份尿样标本，酵母菌阳性你要达到一定的检查技术。

第六、气道的分泌物，包括经口气管插管、支气管肺泡灌洗，保护性毛刷等手段所获取的标本，直接镜检或者细胞学发现菌丝或孢子或者培养阳性。

第七，经腹腔、胸腔、盆腔引流或腹膜透析管引流液所直接镜检和细胞学发现菌丝和孢子或培养阳性。

第八，经脑室引流，脑脊液引流的直接镜检和细菌学发现菌丝跟孢子或培养阳性。

第八条就是血液标本半乳糖甘聚糖，甘露聚糖抗原 GM 试验和 1 、 3 β D 葡聚糖 G 试验，连续 2 次阳性。

所以说上面很多都是培养的技术，对吧。

当然也包括一部分显微镜直接观察。

第九条就是把两个很重要的非培养技术 G 试验和 GM 试验当然还包括脑脊液的隐球菌抗原这样一个非培养的检测技术，作为侵袭性真菌感染的确诊或者临床诊断的一个依据。

所以我们可以看到这个非培养技术特别是 G 试验和 GM 试验以及脑膜炎隐球菌的抗原的检测在信息性真菌病的里面的重要地位。

如果你仅仅是在拟诊的话，你的经验治疗，如果你是临床诊断的话应该抢先治疗，如果确诊就要靶向治疗。

既经验治疗怎么用药，抢先治疗怎么用药还有靶向治疗怎么用药，甚至在血液科还面对一个粒缺的病人还有一个预防用药，这些做一个规范性的一个指南。

下面我们就来介绍第一个 1 、 3 β D 葡聚糖检测，就是 G 试验这个原理和应用。

1 、 3 β葡聚糖广泛的存在于真菌的细胞壁里面，它占到细胞壁干重的 50% ，应该是属于真菌细胞壁的特有成份。

就是除了真菌之外别人没有，别的生物体没有，人也没有，细菌也没有。

这是我们就要查的这个 1 、 3 β葡聚糖的位置，当然还有甘露聚糖，那现在我们也可以去查甘露聚糖。

一般我们今天主要讲的是 1 、 3 β葡聚糖。

1 、 3 β葡聚糖它对热极为稳定，在高压 121 度的时候不能灭活，在念珠菌和曲霉菌细胞壁中含有比较多，所以如果你去检测这个 1 、 3 β葡聚糖对于念珠菌感染跟曲霉菌感染是很重要的。

而且这个 1 、 3 β葡聚糖很有特点它只有真菌进入到人体的血液和深部组织后经过吞噬细胞的吞噬消化才能从细胞壁里面给它释放出来，从而在血液里面和其他体液里面含量增高。

当然随着真菌在体内的清除，比如说你用了抗真菌药了，这个东西你就慢慢下降了。

真因为它是进行吞噬细胞的处理才释放出来，所以在浅部的真菌感染比如说口腔的、皮肤的、或者定植的，它不增高。

因此，对 1 、 3 β葡聚糖的检测能够区分是定植还是感染这是个非常重要的。

痰里培养出细菌来你培养出阳性那可能定植不是感染。

1 、 3 β葡聚糖如果阳性痰里也是阳性，那当然你就多考虑是感染。

用什么方法来检测 1 、 3 β葡聚糖目前主要是用后试验的方法。

2006 年美国 FDA 批准了一个美国公司叫 ACC 公司它所上市的 Fungitell 的这样一个临床事迹和使用。

鲎是什么东西？鲎是一个外形是这样子，甲壳类的动物。

它是一个深海的节肢动物，它将近有几亿年，它非常古老，可以说叫活化石，血是蓝色的，因为它里面的血里面含铜很高，它叫铜蓝蛋白，主要的血这个鲎体的血里面有个变形细胞，相当我们的单核细胞，这个这个粒细胞之类，但是它叫变形细胞。

它有个溶解物，它里面含有很多的物质，这些物质能够被这个 1 、 3 β葡聚糖激活。

我们看内毒素，大家知道内毒素是革兰氏阴性菌的一个产物，查β葡聚糖也是通过鲎试验，在鲎的变形细胞里面会产生 C 因子、 B 因子、凝固蛋白原，还会产生 G 因子，内毒素试验和 1 、 3 β D 葡聚糖试验的检测都是根据鲎，鲎试验原理，只不过它们所激活的途径不一样，你要查 1 、 3 β D 葡聚糖你走这条路。

那我们现在要查的是代测样本中的 1 、 3 β D 葡聚糖是真菌的细胞壁的产物，能够找到它我就能够诊断侵袭性的真菌感染。

在试验当中这个物质如果你血液当中或者什么标本当中有这个东西，我加进去鲎试剂，比如鲎血里面所提出来的 G 因子。

1 、 3 β葡聚糖可以使它活化，变成活化的 G 因子。

那当然试剂里面还有从鲎学里提出来的凝固酶原，它就会变成凝固酶。

凝固酶又会使我试剂中的凝固酶原，凝固蛋白酶，变成凝固蛋白。

再者凝固蛋白整个就会凝了，在血中就会凝固了，变成凝胶了。

整个液体原来是很清亮的。

因为有凝胶就会有浊度。

所以我可以通过测定这个标本的透光率来反应你这个代测物 1 、 3 β葡聚糖的多少。

如果越多那就凝得越多透光率就越差。

如果里面没有那整个你也没有凝，整个透光率是 100% 。

所以我可以透光率来推算出你代测物的含量，这就是所谓的 G 实验。

另外一个方法也是 1 、 3 β葡聚糖也是使 G 因子活化，也是这个作用在这个变成这个 G 因子活化之后它就会变成一个叫丝氨酸蛋白酶，这时候我给试剂里面这个反应体加进一个发色底物，前面是 1234 四个寡肽，后面连着一个发色集团，这个发色集团就是大家很熟悉的对硝基苯胺，如果对硝基苯胺，如果这个丝氨酸蛋白酶从这儿一切，把四个寡肽切下来，把发色集团给游离出来那当然就显色了，它这个黄色在 405 拉美的时候它吸光度最高，我们通过测定吸光度来推测 1 、 3 葡聚糖的含量，这是显色法。

当然用的仍然是鲎血里面的 G 引资这些最原始的这些试剂了。

随着鲎试剂里面的主要成份有蛋白 C 、蛋白 B 、蛋白 G 、凝血，凝固原、凝固蛋白酶等等，还有一些离子。

你要测定 1 、 3 β D 葡聚糖的试剂，你必须要把 C 和 B 屏蔽掉，因为 C 和 B 有参与内毒素的反应。

只保留 G 因子。

那当然这在试剂研发当中所必须解决的一个问题。

那这是真菌的β葡聚糖和内毒素在鲎试验中的反应曲线是不一样的，内毒素它是一个经过 0 点的一个 S 型的特征曲线，而 1 、 3 β葡聚糖是经 0.0 的类似于直，一个直线的曲线。

它的横坐标是它的时间，纵坐标是它的吸光度，当然这是采用的显色法。

目前已经上市的 G 试验的系统均采用透光度与浓度建立相，建立这个检测体系。

它是以 90% 的透光率作为一个临界点，然后根据一个事情要求建立一个反应的时间 T 和β浓度C 之间的一个模型。

检测反应体系当中的浊度达到预定设置的吸光度或者透光率，比如透光率我以 90% ，达到我透光率 90% 所需要的时间有多少秒，这个时间就和我β浓度呈一个线性关系。

一个产品的检测实测图了，这是一个北京金山川的一个试剂。

它先要做标准。

它用标准给它分别吸入了 100 个 PG ， 10 个 PG ，一个 PG ，但是稀释要成稀释度，实际上我们的实际测定值是 1000 、 100 跟 10 这三个水平。

我们看这里有几条线，第一条是蓝色这是一个空白对照。

第一条线这是 1000 个 PG 的标曲，指的是 100PG 的标曲，这个蓝的是 10 个 PG 的标曲，标曲就是说，我这标准搁进去那肯定是 1 、 3 β葡聚糖肯定会激活G 因子最后产生浊度，当它的透光率从 100% 减到 90% 的时候有三个点。