1．1 DNA重组技术的基本工具1．了解基因工程的概念、诞生及发展。

2.掌握限制酶及DNA连接酶的作用。

(重、难点) 3．理解载体需具备的条件。

(重点)一、基因工程(阅读专题1前言部分)基因工程的别名DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平结果新的生物类型和生物产品461．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”(1)来源：主要来自于原核生物。

(2)特点：具有专一性。

①识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。

②切割特定核苷酸序列中的特定位点。

(3)作用：断开每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

(4)结果：产生黏性末端和平末端。

限制酶有特性，“特定”突显专一性。

2．DNA连接酶——“分子缝合针”(1)种类⎩⎪⎪⎨⎪⎪⎧E ·coli DNA 连接酶⎩⎪⎨⎪⎧来源：大肠杆菌特点：只能“缝合”具有互补的黏性末端的双链DNA 片段T 4DNA 连接酶⎩⎪⎨⎪⎧来源：T 4噬菌体特点：既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端又可以“缝合”双链DNA 片段的平末端(2)作用：形成磷酸二酯键。

(3)结果：形成重组DNA 分子。

3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” (1)作用：将外源基因送入细胞中。

(2)种类：质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等。

(3)三、重组DNA 分子的模拟操作(阅读教材P 6～P 7)1．材料用具：剪刀代表Eco R Ⅰ，透明胶条代表DNA 连接酶。

2．切割位点(1)分别从两块硬纸板上的一条DNA 链上找出G —A —A —T —T —C 序列，并选G —A 之间作切口进行“切割”。

(2)再从另一条链上互补的碱基之间寻找Eco R Ⅰ相应的切口剪开。

3．操作结果：若操作正确，不同颜色的黏性末端应能互补配对；否则，说明操作有误。

连一连判一判(1)通过基因工程产生的变异是不定向的。

(×)分析：该变异类型按人们的意愿进行，是定向的。

(2)通过基因工程改造成的生物为新物种。

(×)分析：通过基因工程改造成的生物，使该生物产生新的性状，不属于新物种。

(3)限制酶和DNA解旋酶的作用部位相同。

(×)分析：限制酶作用于磷酸二酯键，DNA解旋酶作用于氢键。

(4)(2018·洛阳高二期末)DNA连接酶起作用时不需要模板。

(√)(5)载体(如质粒)和细胞膜中的载体蛋白的成分相同。

(×)分析：前者为DNA，后者为蛋白质。

(6)(2018·大连二十四中高二检测)作为载体，必须要有标记基因。

(√)基因工程的工具酶探究1限制酶的切割方式(1)上下交错切割：限制酶在DNA双链的不同位置切割DNA(即在识别序列的中轴线两侧切割)，产生的DNA片段末端不是平齐的，即黏性末端，如下图：该Eco RⅠ限制酶的识别序列为—GAATTC—，切点是在G和A之间。

(2)上下对称切割：限制酶在DNA双链的相同位置切割DNA分子(即沿着识别序列的中轴线切割)，这样产生的DNA片段末端是平齐的，即平末端，如下图：该SmaⅠ限制酶的识别序列为—CCCGGG—，切点是在C和G之间。

探究2DNA连接酶的作用E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶均可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，相当于把梯子两边的扶手的断口连接起来。

即：(1)DNA连接酶的作用部位为①(填“①”或“②”)形成磷酸二酯键。

(2)与限制酶的关系观察下图，讨论限制酶切割和DNA连接酶的位置在________(填“1”“2”“3”或“4”)处。

提示：2、4与DNA分子相关的四种酶的比较种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键作用特点切割目的基因及载体，特异性识别核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开将双链DNA片段“缝合”起来，恢复磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上将DNA两条链之间的氢键打开作用结果形成黏性末端或平末形成重组DNA分形成新的DNA形成单链DNA分端子分子子应用基因工程DNA复制突破1限制酶的来源、特点及作用1．下列有关基因工程中限制酶的描述，错误的是()A．一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列B．限制酶的活性受温度、pH的影响，总有一个最合适的条件C．限制酶能破坏相邻脱氧核苷酸之间的化学键D．限制酶不只存在于原核生物中，其合成场所是核糖体[解析]选A。

限制酶只能够识别双链DNA分子的某种特定的脱氧核苷酸序列，不能识别RNA分子的核糖核苷酸序列，A项错误；同其他的酶一样，限制酶同样受温度和pH的影响，而且具有发挥最大催化效率的最适温度和最适pH，B项正确；限制酶催化的是特定部位磷酸二酯键的断裂，属于水解反应，C项正确；限制酶主要从原核生物中分离纯化，也有来自真核细胞的，其本质是蛋白质，在核糖体上合成，D项正确。

2．下表为常用的限制性核酸内切酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，以下说法中，推断正确的是()限制性核酸内切酶识别序列和切割位点限制性核酸内切酶识别序列和切割位点Bam HⅠ↓GGA TCCKpnⅠ↓GGTACCEco RⅠ↓GAA TTCSau3AⅠ↓GATCHindⅡ↓GTYRACSmaⅠ↓CCCGGGA．一种限制酶只能识别一种核苷酸序列B．限制酶切割后一定形成黏性末端C．不同的限制酶可以形成相同的黏性末端D．限制酶的切割位点在识别序列内部[解析]选C。

根据表格内容可以推知，每种限制酶都能识别特定的核苷酸序列，但不一定是一种序列，如限制酶HindⅡ，A项错误；限制酶切割后能形成黏性末端或平末端，B 项错误；不同的限制酶切割后可能形成相同的黏性末端，如限制酶Bam HⅠ和Sau3AⅠ切割后露出的黏性末端相同，C 项正确；限制酶的切割位点可以位于识别序列的外侧，如Sau 3A Ⅰ，D 项错误。

限制酶的识别序列和切割末端的判断(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA 上的碱基是反向对称重复排列的。

如GC,CG)⎪⎪⎪GC CG )以中心线为轴，两侧碱基互补对称；CCAGG,GGTCC)以A,T)为轴，两侧碱基互补对称。

(2)同一种限制酶一定能切出相同的黏性末端，相同的黏性末端不一定来自同一种限制酶的切割，但同样能相互连接。

突破2 DNA 连接酶的作用3．下列关于DNA 连接酶作用的叙述，正确的是( ) A ．将单个核苷酸加到某个DNA 片段的末端，形成磷酸二酯键 B ．将断开的2个DNA 片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键 C ．连接2条DNA 链上碱基之间的氢键D ．只能将双链DNA 片段互补的黏性末端连接起来，而不能将两者之间的平末端进行连接[解析]选B 。

DNA 连接酶和DNA 聚合酶都是催化2个脱氧核苷酸分子之间形成磷酸二酯键。

但DNA 连接酶是在2个DNA 片段之间形成磷酸二酯键，将2个DNA 片段连接成重组DNA 分子；DNA 聚合酶是将单个的核苷酸分子加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯键，合成新的DNA 分子。

DNA 连接酶无识别的特异性，对于相同或互补的黏性末端以及平末端都能连接。

所以，限制酶种类多，DNA 连接酶种类少。

“分子运输车”——载体下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，探究以下问题：(1)a 代表的物质和质粒的化学本质都是DNA ，都能进行自我复制。

(2)若某目的基因切割末端为—A—TGCGC，则与之相连的质粒上至少有一段核苷酸序列为—ACGCGT ——TGCGCA —。

该质粒DNA 分子的切割末端为CGCGT —A —，可使用DNA 连接酶把质粒和目的基因连接在一起。

(3)氨苄青霉素抗性基因，能控制某物质的合成，该物质能抵抗氨苄青霉素，使含有该基因的生物能在含氨苄青霉素的环境中存活。

氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA 上称为标记基因，其作用是供重组DNA 的鉴定和选择。

作为载体应具备的条件(1)载体DNA 必须有一个至多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入载体。

这些供目的基因插入的限制酶的切点，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。

(2)载体DNA 必须具备自我复制的能力，或能整合到受体染色体DNA 上随染色体DNA 的复制而同步复制。

(3)载体DNA 必须带有标记基因，便于重组DNA 的鉴定和选择。

原理如下图所示：高中生物学中的“载体”(1)物质跨膜运输的载体：细胞膜上的一种____________。

(2)基因工程中目的基因的载体：种类有_______、λ噬菌体的衍生物和__________等。

(3)细胞中遗传信息的载体：细胞生物遗传信息的载体是____________。

(4)真核细胞中遗传物质的主要载体是____________。

(5)细胞间信息传递的载体：细胞释放的信号分子，如：激素、神经递质等。

[答案](1)蛋白质(2)质粒动植物病毒(3)DNA(4)染色体1．质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。

下列有关叙述正确的是()A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子B．在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点C．携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择[解析]选D。

质粒不只分布于原核生物中，在真核生物——酵母菌细胞内也有分布，A 项错误；并不是所有的质粒都能找到限制酶的切割位点而成为合适的运载目的基因的工具，B项错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制，C项错误；质粒上抗性基因常作为标记基因，D项正确。

2．(经典题)质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内。

某细菌质粒上有标记基因如右图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。

外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是()细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况细菌在含四环素的培养基上的生长状况①能生长能生长②能生长不能生长③不能生长能生长B．①是a和b；②是a；③是bC．①是a和b；②是b；③是aD．①是c；②是a；③是b[答案]A(1)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同，前者的实质是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞，后者是蛋白质，与细胞膜的选择透过性有关。

(2)一般来说，天然载体不能同时满足上述条件，要对其进行人工改造才可以使用。