—、离心技术1.概念:根据物质的质量、沉降系数及浮力因素等不同，应用高速旋转产生强大的离心力，使物质分离、浓缩、提纯的方法称为离心(centrifugation)技术。

2.离心的基本术语①离心力(F)：在一定角速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力。

F=co2r(3是旋转角速度，以弧度/秒为单位；r是离心转子的半径，以cm为单位)②相对离心力(RCF)：离心力转化为重力加速度(g)的倍数。

RCF= o2r/g= (1.119X10-5) n2r n为转子每分钟的转数(rpm)一般情况下，低速离心时常以转速“rpm”来表示，髙速离心时则以“g”表示。

③沉降系数(S)：颗粒在单位离心力作用下粒子移动的速度。

S的物理意义是颗粒在离心力作用下从静止状态到达等速运动所经过的吋间，单位为秒。

S在实际应用屮常在10-13秒左右,即10-13S为IS o文献屮常用沉降系数以描述某些生物大分子或亚细胞器大小。

3.离心机分类(1)普通离心机：最大转速6000 rpm左右，分离形式是固液沉降分离，转子有角式和外摆式，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。

(2)高速冷冻离心机：最大转速为20000〜25000 rpm,分离形式是固液沉降分离，一般都有制冷系统，通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫镀沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。

(3)超速离心机：转速可达50000〜80000 rpm,分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，离心管平衡允许的误差要小于0.1克。

超速离心机的出现，使生物科学的研究领域有了新的扩展，它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离，还可以分离亚细胞器、病毒、核酸、蛋白质和多糖等。

4.离心管的选用离心管主要用玻璃、塑料和不锈钢制成(1)玻璃离心管绝对不能在高、超速离心机上使用。

(2)塑料离心管常用材料有聚乙烯(PE),聚碳酸酯(PC),聚丙烯(PP)等，其中PP管性能较好。

具体如下：A、PA管：化学性能稳定，半透明，能耐高温消毒。

B、PP管：化学性能稳定，半透明，能耐高温消毒。

C、PC管：透明度好，硬度大，能耐高温消毒。

但不耐强酸强碱及某些有机溶剂。

主要用于5万(转/分) 以上离心。

D、CN管：质地较软，透明，但不耐强酸强碱及某些有机溶剂，不能高压消毒。

适合于蔗糖、廿油等密度梯度离心。

因透明，利于收集。

(3)不锈钢离心管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。

但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。

5.离心机的使用注意事项(1)离心机要置水平位置，以保证旋转轴与地面水平面垂直。

保持良好的通风环境，避免阳光和热源直接照射。

(2)使用前应检查离心机转头转速，不得过速使用。

禁止离心机不加转子空转且确认转子己放稳，一定要选择适宜的转子。

(3)样品倾入离心杯后应与离心管套一起两两平衡(台称)，平衡后把它们放置于转子的对称位置，严禁装载奇数的离心管。

严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。

(4)离心机工作前一定要检查离心机盖是否盖严，之后打开电源开关，调整离心时间。

(5)启动离心时转速应由小至大，缓慢升速，达到预定转速后再调整离心时间至预定时间。

(6)在使用过程屮，若发现声音不正常，应立即停机。

(7)离心结束，要等到转速为零时才能打开离心机盖，取出样品。

调整调速旋钮至零位，同时关闭电源。

（8）每次使用后，要仔细检查转头，及时清洗、擦干。

长期不使用，应将转子取下擦拭涂油并妥善保管。

二、光谱技术（分光光度技术）1.分光光度法的概念:利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计。

2.常用光谱分析术语①光吸收：当一定波长的光通过某介质吋，该介质有选择地吸收某一波长的光，使入射光的强度减弱，这种现象称为光吸收。

②吸光度（A）（absorbance）：又称光密度（OD）或消光度（E）,表示光被吸收的量度。

它与被测溶液的浓度（C）,液层的厚度（L）成正比，消光度越高，溶液对光吸收的程度越大。

③透光度（T）（transmittance） -- 表示光线透过的量度。

通常以百分数表示。

④消光系数（£ ）：是溶液对光吸收的比例常数，消光系数的物理意义是吸光物质在单位浓度以及单位厚度时的吸光度值，用£表示。

£值取决于溶质性质、入射光波长和温度。

£越大，吸收光的能力越强，相应的分光光度法测定的灵敏度就越髙。

4•分光光度计种类（1）可见分光光度计：在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收，但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定，故又称比色分析。

由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。

（2）紫外分光光度计：紫外光/可见光分光光度计基本装置中采用高强度的钩灯作为光源，能够在可见光范围（400〜700nm）调节。

氛灯用于紫外分光光度测量（200〜400nm）；使用氛灯时要用石英杯，因为紫外线不能透过玻璃。

（3）红外分光光度计：（4）原子吸收分光光度计：其屮紫外光区，波长范围为200〜400nim可见光区，波长范闱为400〜700nim红外光区，波长范围为700nm-500g m；无线电波区，波长范围为l・5m。

在生物化学领域里，应用最多的是波长区域是可见光和紫外光。

5.分光光度计的组成及测定原理组成：（1）光源；（2）单色光器（包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统）；（3）样品室（比色杯）; （4）接收检测放大系统；（5）显示或测量仪表。

光源单色器样品室检测放大系统显示器测定原理：光源发生的光经单色光器变为一定波长的单色光，此光通过吸收池，被吸光物质所吸收，吸收后，透出的光照到接受器上产生电流，电流推动测量仪表以光密度或透光率表示出来。

7200型可见分光光度计的使用方法★1.开机前的检查：开机前打开样品室盖，检查样品室内是否有物品挡在光路上。

光路上有阻挡物将影响仪器的自检，甚至造成仪器故障。

2.接通仪器电源，预热20〜30分钟后，用波长选择旋钮设置测试所需波长。

3.将校正黑体置于光路，用〈MODE〉键选择“T”测试方式，调节T为“000.0”。

4.将空白溶液与待测溶液分别倒入比色皿中，把盛有溶液的比色皿放入比色架中（注意比色皿的光面和毛面不要放反），盖上样品室盖，使空白溶液对准光路，用〈MODE〉键选择“T”测试方式，按“100%”键调节光度计读数为“100.0”。

用〈MODE〉键选择“A”测试方式,看光度计读数是否为“0.000”。

如是，则可以开始测定待测溶液的吸光度值。

5.轻轻拉或推动比色架固定拉杆，使第二个比色皿溶液处在光路中，此时读数即为该溶液的吸光度。

6.依次拉或推出第三，第四个比色111L,分别读取溶液的吸光度值。

7.测定完毕，先打开样品室盖，再关闭电源。

将比色皿取出洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。

三、层析技术1.概念和原理：又称色谱技术。

利用被分离混合物中各组分的物理、化学及生物学特性(主要指吸附能力、溶解度、分子大小、分子带电性质及带电量的多少、分子亲和力等)的差异，当它们通过一个由互不相溶的两相一一固定相和流动相组成的体系时，由于混合物各组分在两相之间的分配比例、移动速度不同而将混合成分分开的技术。

层析法是近代生物化学最常用的分析方法2—，运用这种方法可以分离性质极为相似，而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苛酸、糖、蛋白质等。

2.层析分类(1)按固定相分类：根据固定相的形式不同，可分为：纸层析、薄层层析和柱层析。

纸层析：用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开。

薄层层析：将适当粘度的固定相均匀铺在薄板上，点样后，用流动相展开；柱层析：固定相装于柱内，使样品沿着一个方向移动而分离；(2)按流动相分类，可分为：气相层析和液相层析。

气相层析：是指以气体为流动相的层析方法。

根据固定相的性质不同又可以分为气■固层析(GSC)和气•液层析(GLC)o液相层析：是以液体为流动相的层析方法，称Z为液相层析。

同理，根据固定相的性质不同又可以把液相层析分为液■固层析(LSC)和液■液层析(LLC)o(3)按分离原理分类，可分为：①凝胶层析(gel chromtography)：凝胶层析又称为凝胶过滤、分子筛过滤、凝胶渗透层析等。

其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相(凝胶)具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开从而达到分离的方法。

分子筛效应：凝胶颗粒具有多孔网状结构，小分子易进入凝胶网孔，流程长而移动速度慢，而大分子物质不能进入凝胶网孔，沿凝胶颗粒间隙流动，流程短移动快。

分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量由大到小的顺序流出层析柱，凝胶表现分子筛效应，凝胶层析又称分子筛层析。

②离子交换层析(Ion exchange chroma tography)：离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相屮的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。

③吸附层析(absorption chromatography)：吸附层析是指待分离混合物随流动相通过由吸附剂组成的固定相时，由于吸附剂对待分离混合物中不同组分的吸附力不同，从而使混合物中各组分得以分离的一种层析方法。

吸附层析常应用于：A.生物大分子物质的分离、纯化与分析；B.小分子化合物的分离、纯化及分析；C.稀溶液的浓缩④分配层析(partition chroma tography)：被分离组分在固定相和流动相屮不断发生吸附和解吸附的作用，在移动的过程中物质在两相之间进行分配。

利用被分离物质在两相中分配系数的差异而进行分离的一种方法,称Z为分配层析。

⑤亲和层析(afinity chromatography)：在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的毗基，这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离的一种方法，称之为亲和层析。

⑥金属螯合层析(metal chelating chromatography)利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金屈离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金屈离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪卩坐及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法，称之为金属螯合层析。

⑦疏水层析(hydrophobic chromatography):^用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法，称之为疏水层析。