原生质体融合技术筛选高产虾青素酵母菌株刘虹;程秀芳;张志焱;谷巍【摘要】采用原生质体融合技术,以红发夫酵母突变株和黏红酵母突变株为亲本菌株,以原生质体形成率和再生率的乘积为检测指标,对菌株菌龄、酶解温度、酶解时间和渗透压稳定剂等原生质体形成和再生的条件进行研究.结果表明,处于对数生长前期的红发夫酵母和处于对数生长中期的黏红酵母原生质体形成率和再生率的乘积显著高于其他组(P＜0.05);红发夫酵母原生质体形成率和再生率的乘积在酶解温度22℃时为17.34％,在25和28℃时为0,黏红酵母形成率和再生率的乘积在22和25℃时显著高于28℃(P＜0.05),但2个温度之间差异不显著(P＞0.05);2菌株原生质体形成率和再生率的乘积在酶解时间为2h时显著高于其他组(P＜0.05);对照组渗透压稳定剂的组合对原生质体形成率和再生率的乘积显著高于其他组(P＜0.05).红发夫酵母和黏红酵母原生质体形成和再生的最适条件为:红发夫酵母菌龄为14 h、黏红酵母菌龄为18h、酶解温度均为22℃、酶解时间均为2h,原生质体形成的最适渗透压稳定剂均为1.0 mol/L的KCl缓冲液,再生的最适渗透压稳定剂均为17％蔗糖稀释液;最后筛选出1株能在28℃生长良好且虾青素含量586.38 μg/g的融合子,比融合前红发夫酵母和黏红酵母分别提高了79.58％和64.08％,且传代多次生产性能稳定.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2013(040)010【总页数】6页(P156-161)【关键词】红发夫酵母;黏红酵母;原生质体;蜗牛酶;溶菌酶【作者】刘虹;程秀芳;张志焱;谷巍【作者单位】山东宝来利来生物工程股份有限公司,山东泰安 271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司,山东泰安 271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司,山东泰安 271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司,山东泰安 271000【正文语种】中文【中图分类】Q242虾青素全称为3，3′－二羟基－4，4′二酮－β，β′－胡萝卜素，是一种非维生素A原含氧类胡萝卜素，在动物体内不能转化为维生素A，但它是一种不断链抗氧化剂，可高效的淬灭单线态氧和清除自由基，因而虾青素享有“超级维生素E”的美誉（Miki，1991）。
目前已被广泛应用于饲料、食品、医药、化妆品和保健品的生产，国际市场需求量较大，应用前景非常广阔。
Phaff等（1972）在美国的阿拉斯加和日本的高纬度地区首先分离到红发夫酵母（Phaffia rhodozyma）。
Andrewes等（1976）发现该菌能产生虾青素；Johnson（1980）把发酵培养菌体应用于鱼和鲟鱼的饵料中，获得了良好的养殖效果。
红发夫酵母在其所产类胡萝卜素中，虾青素所占比例为60%～85%，但由于虾青素是胞内色素，是一种与细胞生长相偶联的次级代谢产物，且红发夫酵母最适生长温度低，菌体生长缓慢，所以虾青素的产量也比较低。
目前高产虾青素酵母菌株主要是通过反复多次诱变和筛选（田小群等，2003），但反复多次诱变会有许多对生产发酵有毒的突变，且会产生抗药性，难以再大幅度提高产量（Chun等，1992）。
原生质体融合（protoplast fusion）可发生在种内、种间，甚至亲缘关系很远的2个物种之间，可以扩大融合频率和幅度，是一种常见的育种方法，具体是用水解酶去除细胞壁，释放出只有原生质膜包被的球状原生质体，然后用物理或化学方法诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。
由于原生质体融合能显著提高重组频率及进行定向育种，因此该技术被广泛应用于细胞育种。
本试验利用原生质体融合技术，用蜗牛酶和溶菌酶使红发夫酵母和黏红酵母细胞破壁，并对影响原生质体形成和再生的几个因素做了探讨，使原生质体的形成率和再生率达到一个较高的水平，为以后以酵母原生质体为媒介的育种和融合技术提供较好的试验系统，以期获得1株遗传稳定性好、高产虾青素的融合菌株。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株红发夫酵母突变株和黏红酵母突变株均由山东宝来利来生物工程股份有限公司菌种保藏中心保存。
1.1.2 培养基 YPD液体培养基：葡萄糖10g、酵母浸膏3g、麦芽汁3g、蛋白胨5g、水1000mL；固体培养基A：液体培养基上加琼脂20g；固体培养基B：将固体培养基A中的葡萄糖改为50g；发酵培养基：葡萄糖20g、酵母膏10g、（NH4）2SO45g、KH2 PO41g、MgSO4·7H2O 0.5g、CaCl2·2H2O 0.1g、水1000mL，初始 pH 6.0；再生完全培养基：YPDK、YPDC和YPDT高渗固体培养基配方分别在YPD固体培养基B基础上加1.0mol／L KCl、0.8mol／L甘露醇和17%蔗糖。
1.1.3 试剂 0.1mol／L pH 6.0磷酸缓冲液，121℃灭菌20min。
高渗缓冲液：PCK、PCT和PCC液分别为用0.1mol／L pH 6.0磷酸缓冲液配制的1.0mol／L KCl、17%蔗糖和0.8mol／L山梨醇，121 ℃ 灭菌 20min。
预处理剂（现配）：0.05mol／L EDTA、0.5mol／Lβ－巯基乙醇，均用高渗缓冲液配制。
酶液：蜗牛酶和溶菌酶均购自北京欣经科技生物技术有限公司。
PCK酶液、PCT酶液和PCC酶液分别用PCK液、PCT液和PCC液配制的1.0mg／mL蜗牛酶和0.5mg／mL溶菌酶，酶液需现配，配好后经0.22μm微孔滤膜过滤。
原生质体稳定液（SMM，现配）：0.5mol／L 蔗糖、0.02mol／L MgCl2、0.02mol／L 顺丁烯二酸，pH 6.5，121℃灭菌20min。
促溶剂（现配）：40%PEG（W6000）的SMM溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤。
1.2 方法1.2.1 菌龄对原生质体形成与再生的影响取生长期3个阶段的2株菌菌液制备原生质体，酶系统中酶总浓度为1.5%，高渗缓冲液为PCK液，酶液由PCK液配制，酶解时间为1h，酶解温度为22℃。
1.2.2 酶解温度对原生质体形成与再生的影响选择22、25和28℃3个酶解温度，酶系统其他条件同1.2.1。
1.2.3 酶解时间对原生质体形成与再生的影响在最适菌龄及酶解温度下，选择1、1.5和2h3个酶解时间，酶系统中其他条件同1.2.1。
1.2.4 渗透压稳定剂对原生质体形成与再生的影响在最适菌龄、酶解温度及酶解时间条件下，选用1.0mol／L KCl、0.8mol／L 山梨醇和17%蔗糖为渗透压稳定剂，配制混合酶液、稀释液及再生培养基，同时以 PCK 酶液－1.0mol／L蔗糖稀释液－YPDK再生培养基组合为对照，酶系统中其他条件同1.2.1。
1.2.5 菌体的培养红发夫酵母的培养：将斜面种子转接种子培养基，温度22℃，转速180r／min培养24h，再按10%（V∶V）接种量接入发酵培养基培养72h。
黏红酵母的培养：将斜面种子转接种子培养基，28℃、150r／min培养24h，10%接种到二级种子培养基培养12h，再将二级种子以10%（V∶V）的接种量发酵培养基，28℃、150r／min培养72h。
2菌株生长曲线发酵培养基是YPD液体培养基，融合菌株发酵培养基为1.1.2的发酵培养基。
1.2.6 生长曲线的测定采用细胞干重法（诸葛健等，1994）测定生长曲线。
1.2.7 原生质体的制备、再生与剩余菌数的测定取培养好的菌液2mL，3500r／min离心5min收集菌体，2mL磷酸缓冲液洗涤1次，再用高渗缓冲液洗涤1次，将菌体悬浮于2mL高渗缓冲液中，振荡均匀；取0.2mL样品，用生理盐水稀释，取相应梯度的稀释液涂布在完全培养基平板上，培养48h后进行菌落计数，再取2mL菌液于无菌小试管中，3500r／min离心10min，弃上清收集菌体，加入5mL 0.05mol／L EDTA、0.4mL 0.5mol／Lβ－巯基乙醇，28℃预处理10min，离心并用高渗缓冲液洗脱2次，再加入2mL含2mg蜗牛酶和1mg溶菌酶的高渗缓冲液，28℃、130r／min振荡保温，每30min取样镜检1次，至80%细胞变成球状原生质体为止，此时原生质体形成，离心，去除酶液，高渗缓冲液洗涤2次得原生质体，再将原生质体悬液稀释到约1×102个／mL。
取100μL原生质体悬液到再生培养基平板上涂布，22℃培养3d，计算原生质体形成率和再生率（王殿夫等，2002）。
形成率和再生率的计算采用平皿菌落计算的方法（曲秋皓等，1998）。
公式为：式中，A为酶处理前的活菌计数，B为酶处理后未脱壁的活菌计数，C为酶处理后未脱壁的活菌数与原生质体再生菌落数之和。
1.2.8 原生质体再生后的筛选用接种针挑取原生质体融合后长出的菌落，转接到发酵培养基，28℃、180r／min培养3d，测定生物量、虾青素含量和虾青素产量，并计算虾青素产量的提高率。
1.2.9 融合菌株产虾青素稳定性试验把筛选出产量高的菌株在固体培养基B上进行10次传代培养，再进行发酵培养，测定生物量、虾青素含量和虾青素产量，方法同1.2.8。
1.2.10 虾青素提取及其含量的测定参考许培雅等（2001）方法进行。
1.2.11 数据分析试验数据用平均值±标准差表示，采用统计软件SPSS 13.0中One－Way ANONA进行单因素方差分析，平均值的多重比较采用Duncan氏多重比较检验，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析2.1 菌龄对原生质体形成与再生的影响以时间为横坐标，细胞干重为纵坐标，绘制红发夫酵母和黏红酵母的生长曲线。
红发夫酵母在经过12h的延迟期后，进入对数生长前期，至36h对数生长期基本结束，开始向稳定期过渡，48h菌体生物量达到最大值，48h后随着培养时间的延长，生物量有所下降。
黏红酵母在培养10h后进入对数生长早期，到30h后对数生长期基本结束，进入平衡期。
分别吸取红发夫酵母和黏红酵母生长期3个阶段的菌液制备原生质体，结果见表1。
由表1可知，不同菌株、不同生长阶段菌体对酶液的敏感程度有很大差异。
红发夫酵母原生质体的形成率及形成率和再生率的乘积高低顺序为：对数生长前期＞对数生长中期＞稳定期，再生率高低顺序为：对数生长中期＞对数生长前期＞稳定期；黏红酵母原生质体再生率及形成率和再生率的乘积高低顺序为：对数生长中期＞对数生长前期＞稳定期，形成率高低顺序为：对数生长前期＞对数生长中期＞稳定期。
综合形成率和再生率2方面的因素，以下试验红发夫酵母采用处于对数生长前期的菌体，最适菌龄为14h；黏红酵母采用处于对数生长中期的菌体，最适菌龄为18h。