PPT学习交流
6
洁净级别—无菌药品生产所需的洁净 区可分为4个级别
• A级：高风险操作区，如灌装区、放置胶塞桶和与无菌制剂直接接 触的敞口包装容器的区域及无菌装配或连接操作的区域，应当用单 向流操作台（罩）维持该区的环境状态。单向流系统在其工作区域 必须均匀送风，风速为0.36-0.54m/s（指导值）。应当有数据证明 单向流的状态并经过验证。在密闭的隔离操作器或手套箱内，可使 用较低的风速。
PPT学习交流
17
无菌操作—器皿的消毒
• 所有用到的器皿（买时已灭菌的除外）都必须经过高压灭 菌烘干后才能放入超净台内
• 已灭菌的、外包装完好的培养瓶、离心管、冻存管等可以 表面经75%酒精擦拭后直接放入超净台
• 凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的 瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面
PPT学习交流
16
生物安全柜
• 生物安全柜一般是做致病菌，霉菌，酵母菌，病毒来用，操作区域 是负压，简单说是往上处抽风的，当然致病菌也不是直接抽出排到 室外，是过滤在生物安全柜的顶部漏器上，从排风量上可以分为， 50%外排型，75% 以及100%外排型。在生物安全柜内所形成的几乎没 有微生物的环境中，尽量避免使用明火，酒精灯的火焰可能会影响 室内的气流平衡。
PPT学习交流
9
洗手和着装
PPT学习交流
10
洗手和着装
PPT学习交流
11
洗手和着装
PPT学习交流
12
洗手和着装
PPT学习交流
13
无菌操作—个人防护
• 在实验室工作时必须使用个体防护装备 • 个人衣服和普通实验服不能穿入细胞培养室内 • 实验室内不能穿长摆裙，短裙及短裤，不得在实验室内穿露脚趾的鞋
• 一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75% 酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒
PPT学习交流
15
超净工作台
• 超净台是做一般对人体没有直接伤害的 常规细菌的操作实验，正压送风，工作 台工作区域的气流形成为水平层流型。 区内空气经初效过滤器过滤后，由风机 压入静压箱，再经高效过滤器过滤，由 此送出的洁净气流，以一定的均匀断面 风速通过操作区将尘埃颗粒带走，从而 形成高洁净的工作环境。超净空气的流 速为２４～３０ｍ／ｍｉｎ，这已足够 防止附近空气可能袭扰而引起的污染， 这样的流速也不会妨碍采用酒精灯或本 生灯对器械等的灼烧消毒
细胞培养之无菌操作
PPT学习交流
1
Hale Waihona Puke 录PPT学习交流2
• 无菌
• 定义：对一个环境所谓的无菌，是指在环境中一切有生命活动的微生 细胞及其芽胞或孢子都不存在
• 无菌技术
• 定义：无菌技术是细胞工程的基本技术包括实验器具和材料的准备、 超净台的消毒、洗手和着装、无菌操作等
• 意义：因体外培养细胞没有抗感染能力，防止污染则是决定培养成功 要条件，即便是在设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作 也会导致污染。为在一切操作中尽可能保证无菌，每一项工作我们都 有条不紊和完全可靠。
• B级：指无菌配制和灌装等高风险操作A级洁净区所处的背景区域。
• C级和D级：指无菌药品生产过程中重要程度较低操作步骤的洁净区。
PPT学习交流
7
实验器具和材料的准备
• 在开始实验前要制定好实验计划和操作计划，有关数据的计算要事先 做好。根据实验要求，准备各种所需耗材物品及试剂，清点无误后将 其放置在操作场所进行消毒处理。
• 凡是需要带入安全柜（超净台）的培养基、胰酶、培养皿（培养瓶） 等耗材和试剂在经过消毒处理之后再用75%的酒精棉球擦拭表面。
PPT学习交流
8
培养室的消毒
•进入无菌实验室前先穿好无菌服、戴帽子及口罩 •无菌实验室每周用0.2%的新洁尔灭拖洗地面、粘尘杆去除灰尘，再用 臭氧消毒 •室内台面要保持洁净，做完实验后用75％酒精或千分之三新洁尔灭棉 球擦拭超净工作台的台内、边台的台面、倒置显微镜的载物台等 •实验所用物品尽可能一次性准备好，避免多次出入
PPT学习交流
5
消毒
• 75%酒精消毒原理
• 酒精之所以能消毒是因为酒精能够吸收细菌蛋白的水分，使其脱水变 性凝固，从而达到杀灭细菌的目的。如果使用高浓度酒精，对细菌蛋 白脱水过于迅速，使细菌表面蛋白质首先变性凝固，形成了一层坚固 的包膜，酒精反而不能很好地渗入细菌内部，以致影响其杀菌能力。 75%的酒精与细菌的渗透压相近，可以在细菌表面蛋白未变性前逐渐不 断地向菌体内部渗入，使细菌所有蛋白脱水、变性凝固，最终杀死细 菌，酒精浓度低于75%时，由于渗透性降低，也会影响杀菌能力。
子 • 实验室内严禁处理和配戴眼镜 • 严禁穿着细胞培养室专用防护服离开实验室 • 发生手套破损应立即更换
PPT学习交流
14
无菌操作—超净台的消毒
• 超净工作台台面每次实验前要用75%酒精擦洗，然后用紫外 线消毒30min
• 在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫 外线
• 消毒时工作台面上用品不可过多堆放，否则会遮挡射线降 低消毒效果
PPT学习交流
4
消毒
• 新洁尔灭消毒液 •原理：新洁尔灭灭菌原理为破坏细胞膜、改变其渗透性而起杀菌作用
• 84消毒液 •84消毒液是一种以次氯酸钠为主的高效消毒剂，主要成分是次氯酸钠 次氯酸钠的漂白性是其与水反应生成的次氯酸所带来的，因次氯酸具 有极强的氧化性，能够将大多数物质氧化，使其变性，因而能起到消 毒作用
PPT学习交流
18
无菌操作—细胞处理
• 超净台经过30min紫外灭菌后，才能打开通风装置
• 开始工作的第一步就是点燃酒精灯，之后的一切操作都需 在火焰近处并经过烧灼进行，动作要轻、准确，不能乱碰。 如吸管不能碰到废液缸，继续使用的器皿（如瓶盖、滴管） 要放在高处，使用时仍要过火
• 消毒灭菌
• 消毒：是指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。通常 方法来达到消毒的作用。用于消毒的化学药物叫做消毒剂。
• 灭菌：杀灭或除去特定环境或物品中一切微生物的过程。目前标准规 过程必须使灭菌物品污染的微生物存活率减少到10-6及以下。
PPT学习交流
3
消毒剂种类
• 依据化学成分主要分为9种 • 醛类消毒剂 • 杂环类消毒剂 • 含氯消毒剂 • 过氧化物类消毒剂 • 含碘消毒剂 • 季铵盐类消毒剂 • 酚类消毒剂 • 胍类消毒剂 • 醇类消毒剂 • 重金属类消毒剂 • 生物类消毒剂