12)
13)让胶完全凝结，室温下30-45min,小心拔出梳子，将凝胶安放到电泳槽中；
14)
15)向电泳槽中加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶1 mm；
16)
17)混合DNA样品和0.2倍体积的6xloading buffer,用微量移液器将样品混合液缓慢加至加样孔中；
18)
19)1关上电泳槽盖子，接好电极插头，设好电压和时间，按Run键，DNA应向阳极移动；
100 mM DHA
DHA原装瓶为50 mg，加入1758l DMSO溶解，配成浓度为100mM的储存液，分装避光储存于-20℃备用。
100 mM 5-Fu
用DMSO配成浓度为100 mM的储存液，分装避光储存于-20℃备用。
实验方法
细胞冻存（HEK293细胞为例）
1.消化细胞并700rpm离心5min收集细胞；
DMEM细胞培养基
DMEM溶液90%(v/v)，FBS 10%(v/v)，青霉素100U/ml，链霉素100g/ml
McCoy’s5A细胞培养基
McCoy’s5A溶液90%(v/v)，FBS 10%(v/v),青霉素100 U/ml，链霉素100g/ml
实验试剂及药品的配制
1 mol/L Tris-HCl (pH8.0)
2.
3.查询该基因有表达的细胞株，培养细胞，采用Trizol法提取总RNA。
4.
5.反转录。
6.
7.PCR：首先进行预实验，跑胶初步判断大小，摸索最佳退火温度和体系。然后进行回收目标片段。
8.
9.连接18T vector：载体和插入片段的比例为1:3。
10.
11.转化感受态细胞，筛选单克隆。
12.
13.挑取单克隆至1ml LB液体培养基（含抗生素）中，37℃，300rpm，约10~12 h，小抽并且进行酶切验证。
20)
21)当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔下插头和打开电泳槽盖，取出胶放入凝胶成像仪中拍照。
22)
RT-PCR
1)根据所测的RNA的浓度，计算上样500 ng的RNA样品所需的体积，用DEPC水补至5 ul，加入1 ul的6xloading buffer进行电泳：120V、15 min。
G418 (Neomycin)
用PBS (pH 7.4)配成浓度为50 mg/ml的原液，0.22m滤膜过滤除菌，分装储于-20℃备用。
基因组DNA提取液
1 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)1 mL和0.1 mol/L EDTA (pH8.0)溶液20 ml，0.5% (m/v) SDS，加灭菌去离子水定容至100 ml，备用。
17）用适量ddH2O或者TE溶解DNA沉淀，得比较纯净的DNA，测浓度。
琼脂糖凝胶电泳
1)配制足量的电泳缓冲液（1xTAE或0.5xTBE）用以灌满电泳槽或配制凝胶；
2)
3)根据欲分离DNA片段的大小用电泳缓冲液配适宜浓度的琼脂糖溶液：准确称量琼脂糖干粉加到盛好电泳缓冲液的玻璃瓶中；
4)
5)玻璃瓶松松盖住，沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖溶化；
TAE电泳缓冲液(50×)
242 g Tris碱，57 ml冰乙酸，100 ml0.5MEDTA，加灭菌去离子水定容至1000 ml，使用时稀释50倍。
10% SDS
将10 g高纯度的SDS置于烧杯中，加入约80 ml的ddH2O，68℃加热溶解，滴加盐酸调节pH值至7.2，定容至100 ml后，室温保存。
500 mmol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0)
在800 mL的双蒸水中加入18.6 g乙二铵四乙酸二钠，充分溶解后，用10 mol/L NaOH溶液调pH至8.0，用双蒸水定容到1000 ml。121℃高压灭菌15 min，备用。
溴化乙锭(EB)
1 g EB，加入100 ml灭菌双蒸水中，磁力搅拌数h以确保其完全溶解，然后转入棕色瓶中，4℃保存。
（solutionⅡ配置：0.4 M NaOH：2% SDS=1：1）；
5）加入3.5 ml预冷的solutionⅢ，轻柔颠倒几次，充分混匀，中和裂解液的碱性；
6）冰浴10 min，使杂质充分沉淀；
7）12,000 rpm离心10 min（4℃），轻轻吸取上清800 μl/管，转移至干净的1.5 ml离心管中；
蛋白提取液
1M Tris-HCl (pH7.6) 5 ml，5MNaCl 3 ml，10%SDS 1 ml，100% NP-40 1 ml，加灭菌去离子水定容至100 ml，备用。
100 mM姜黄素
用DMSO配成浓度为100 mM的储存液，分装避光储存于-20℃备用。
100 mM CPT-11
CPT-11原装瓶为50 mg，加入802l DMSO溶解，分装储存于-20℃备用。
6)
7)加入Buffer DE-B，混合均匀。
8)
9)将上步骤的所得液体加入DNA制备管中12,000×g离心1min，弃滤液。
10)
11)加入500ul Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。
12)
13)加700ul Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液。
14)
2.
3.吸除上清，沉淀用冻存培养基（80% DMEM，10%FBS，10%DMSO，现配现用）充分重悬；
4.
5.将细胞悬液分装至冻存管中，1ml/管，标注细胞名称/型号、代数、日期、操作者，并迅速放于室温的冻存盒内；
6.
7.-80℃过夜，然后转移至液氮罐中冻存。
8.
细胞复苏（HEK293细胞为例）
1.将冻存的细胞迅速从液氮罐中取出，放入37℃水浴中进行溶解至无冰晶；
4℃forever
PCR产物胶回收
1)按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书步骤，制备含大加样孔的1%琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物加入加样孔。
2)
3)电泳结束后，在320nm波长紫外灯下根据Marker指示快速切取目的片段，用纸巾转移至Ep管，秤取其重量。
4)
5)加入相应体积的溶胶液Buffer DE-A，水浴锅75℃加热至凝胶完全融化（约6-8min）。
4)
5)氯仿200ul/管，剧烈震荡15s（Don’t Vortex！），使细胞充分裂解,室温静止3min.
6)
7)4℃，12000rcf，15min.
8)
9)转移500ul上清到相应的做好标记的1.5ml的离心管中，加入500ul/管异丙醇，颠倒混匀，室温静止10min。4℃，12000rcf，15min.
主要培养基的配制
LB液体培养基
胰蛋白胨10 g，酵母浸出物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 ml，用1 mol/L HCl调节pH至7.4，121℃高压灭菌20 min。如果需要加抗生素，则待灭过菌的培养基温度降到55℃以下后加入适量的抗生素储存液。
LB固体培养基
在LB液体培养基中加入2%琼脂。
6)
7)用隔离手套转移玻璃瓶到55℃箱内后，待溶化的凝胶稍冷却后加入EB，终浓度为0.5 ug/ml,轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液；
8)
9)琼脂糖冷却时，用一合适的梳子形成加样孔，梳齿的位置应在托盘底面上0.5-1.0 mm,这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔；
10)
11)浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具；
10)
11)弃上清，加入用DEPC水配好的75%的乙醇1ml/管，颠倒两次后，放4℃离心机，7500rcf，5min.
12)
13)弃上清，等RNA干燥透明后加入30ul的DEPC水，吹打混匀使得RNA溶解后，1%凝胶电泳分析（100V 15-20 min），置于-80℃冰箱保存。
14)
基因克隆
1.查找目标基因的基本信息，查找相关文献，设计克隆基因方案。利用DNA处理软件和引物设计软件设计引物，将引物序列送公司合成，根据合成引物的退火温度确定PCR退火温度。
2.
3.取冻存的Ecoli,37 ℃融解后接种于LB平板上，37 ℃培养16-20h。
4.
5.在平板上挑取单菌落（2-3mm）,转到含有100mlLB培养基的1L的烧瓶中，37 ℃剧烈振荡培养（250-300r/min）3h。
6.
7.去1.5mlEp管，加入1mlLB培养基，再加入200ul菌液，37 ℃振荡孵育过夜（300rpm/min）。
14.
15.将沉淀用25ml预冷的0.1MCacl2重悬，按步骤7重复一次，弃去Cacl2溶液。
16.
17.用2ml 预冷的0.1MCacl2重悬沉淀（轻柔），然后在冰上放置1h.。
18.
19.在重悬的菌液中加入丙三醇（甘油）（15% v/v）(即857ul 50%灭菌甘油)，充分混匀后分装，200ul或100ul每管（1.5mlEp管），-80℃保存。
14.
15.测序：挑取酶切验证正确的阳性克隆送测序。
16.
17.根据测序结果，将测序正确的片段连接入真核表达载体。实验室有多种表达载体，根据需要选择。连接体系参考T4Ligase说明书。
18.
19.连接产物转化感受态，挑选阳性克隆进一步酶切验证，挑取阳性克隆中抽质粒并纯化，瞬转真核细胞（根据课题的方向选择细胞株），Western Blot验证所构建的表达载体是否在该细胞株中表达。
8.
9.在无菌的500ml烧瓶中加入50mlLB培养基，加入0.5-1ml 培养过夜的的菌液（即稀释50-100倍），然后与37 ℃300r/min 振荡孵育OD600=0.6(0.4-0.6)(约2h)。
10.
11.当菌液密度达到0.6以后，将菌液在冰上放30min.。
12.
13.将菌液在转入50ml离心管，4 ℃2500rpm, 离心20min,弃上清。