DNA 扩增
•模板 DNA •引物
FIP F3 BIP B3 •Bst DNA 聚合酶
•dNTPs •反应缓冲液
RNA 扩增
•模板RNA •引物
FIP F3 BIP B3 •Bst DNA聚合酶 •逆转录酶 •dNTPs •反应缓冲液
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LAMP法实验室常规操作步骤
样本
DNA/RNA 抽取、提纯
样本中 RNA/DNA的抽取
★病毒 Loopamp H5亜型インフルエンザウイルス检测试剂盒（体外診断用医薬品） Loopamp SARS冠状病毒检测试剂盒（体外診断用医薬品） Loopamp 诺如病毒GI 检测试剂盒 Loopamp 诺路病毒GII 检测试剂盒 Loopamp 引物组WNV Loopamp 引物组Avian Flu H5 Loopamp 引物组Avian Flu H7 Loopamp 引物组KHV （指針収載） H1 pdm 2009引物组（干燥剂形用） FluA引物组（干燥剂形用）
dNTPs
DNA Polymerase Mg2+, DNA
P2O74- + 2 Mg2+
DNA-(dNMP)n + nPPi
Mg2P2O7
PPi = P2O7
( White precipitate)
11
LAMP法结果判断方式① ----目视检查混浊
dNTPs
DNA Polymerase Mg2+, DNA
Loopamp H5亚型禽流感检测试剂盒
27
应用LAMP法的诊断试剂
•Loopamp® SARS冠状病毒检测试剂盒
2003年12月、作为体外诊断用医药品开始销售
•Loopamp® H5亚型禽流感病毒检测试剂盒
2008年11月、作为体外诊断用医药品开始销售
•Loopamp® 支原体P检测试剂盒
2010年5月24日、
一 步 扩增 反 应 检测
2
LAMP法和PCR法的比较
温度 时间 产物量 特异性
检测 试剂
LAMP
PCR
◎ 反应全程恒温
△ 必须要有热循环
◎ 约１５～６０分钟
△ ２～３小时
◎ 约１０１０倍 (100亿倍) △ 约１０７倍 (1千万倍)
◎
极高 ６区域 ４ 引物
无需其他检测步骤， ◎ 根据扩增反应发生与
结果判定的考虑：
不仅仅通过实时浊度，荧光・目视法也能进行结果判断。
20
简易操作过程（以甲型流感为例）
提取咽拭子
放在抽取液中
加入反应引物
加入样本
用干粉试管 提取样本
干粉状试剂 （可常温保存）
1小时之内
新型 A型
颠倒混合5次
RT-LAMP 反应 35分钟
结果判断 目测或浊度仪
检测完成
LAMP=快速、简便、高特异、低成本
⇒ 无需用电泳、特殊探针等，可通过浊度仪、荧光目 视方法确认扩增结果
从扩增到检测可在1个反应试管内（封闭系统）完成
⇒ 可防止由于扩增产物产生的污染。
从RNA经一步反应可完成扩增
⇒ 无需另外进行逆转录反应
23
LAMP法的应用
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LAMP法的应用领域
灵活运用能够简单、快速地进行基因扩增的特征，在各个领域得到广 泛应用。
否判断
△ ２区域 ２ 引物 △ 需其他检测步骤
◎ 无需特殊试剂
◎ 无需特殊试剂
简单、快速、准确的基因扩增法
3
LAMP法的引物设计
4
LAMP法使用的酶
链置换型DNA聚合酶: Bst DNA Polymerase
•扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链伸长。 •LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。
5’ B1c B2
Loop Primer F F2
F1 5’
F1c
(11)
B1c B2c B2
3’ B1 B1c
9
环引物的应用 ②
RNA
PS A
癌症转移标志基因
DNA
CYP2C19 公牛特异性序列
HBV
λDNA
快速法（Loop Primer ：有） 标准法（Loop Primer ：无）
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LAMP法结果判断方式① ----目视检查混浊
F1c
F1 F2c F1c FIP
F1
F2c F2
B2
F2c F2
F1
B1c
F1c
F1c FIP
(9)
F1c
F2c
F2
F1 F1c
F1
B1 B2 B1c F1c F2 F1
B1c B2c B1 B1
B2 B2c
B1c
F1 F2c F1c F1
F2c F2 F1c
B1c BB11cB2 B2c B1
B1c
★SNPｓ（单碱基多型） Loopamp P450タイピング试剂盒(CYP2C19＊2) Loopamp P450タイピング试剂盒(CYP2C19＊3) Loopamp P450タイピング试剂盒(CYP2C9＊3)
★其他 Loopamp 牛胚胎性别判断试剂盒
Loopamp 诺如病毒GⅡ 检测试剂盒
• MRSA • 疟疾 • 肠毒毒素大肠杆菌
腮腺炎病毒 麻疹病毒 RSV
• 组织侵袭性大肠杆菌（EIEC） 日本脑炎病毒
• 伪膜性结肠炎
• Enterococcus faecalis • 口腔细菌（齿周炎病菌）
细小病毒B19 风疹病毒
登革热病毒
• 绿脓杆菌
埃博拉病毒 腺病毒 流感病毒 HPV HAV
食品・环境检测用 Loopamp 沙门氏菌检测试剂盒 Loopamp 肠道出血性大肠杆菌检测试剂盒（公定法収載） Loopamp ベロ毒素(VT)タイピング试剂盒 Loopamp 大肠杆菌O157检测试剂盒
Loopamp L.monocytogenes 检测试剂盒 Loopamp カンピロバクター 检测试剂盒 Loopamp 引物组 A.acidoterrestris Loopamp 引物组 冷水病菌（指針収載）
LAMP技术原理及应用
北京蓝谱生物科技有限公司
米佳 E-mail: mijia@
Tel: 010-82101210/11 Mob: 15601353246

1
基因检测的流程
从样本中抽取、提纯 DNA、RNA
PCR
扩增 二 步 反
(4)
3’ F3c F2c F1c
5’ F3 F2 F1
＋
5’
解离链
F1c F2 F1
(5)
F1
F2
5F’ 1c5’
环状构造
(6) 5’ F1c F2 F1
3’ F1 F2c F1c
(7) 5’ F1c F2 F1
3’ F1 F2c F1c
＋
(8)
F2c
F1c 解离连
F1 3’
环状构造
B1 B2 B3 5’ B1c B2c B3c 3’
Purified HBV genomic DNA was used as a template.
Turbidity
15
推荐理由
采用闭管扩增，可从源头上控制气溶胶污染
实时检测，可根据各引物反应时间、效率筛选 最佳引物及反应浓度
LAMP反应时间的确定
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误区：选择阴性对照不反应的引物
0.8
0.7
・雌雄性别判断
・病原微生物的检
测 ・遗传病的发现
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II. LAMP法について
LAMP法的应用例（科研）
论文报告（科研・临床对象）
• 细菌・真菌・寄生虫
• 结核菌、耐酸菌 • 肺炎链球菌 • 支原体 • 流感嗜血杆菌 • 百日咳菌 • 绿脓杆菌（MDR）
• 病毒
HSV CMV VZV EBV HHV-6 HHV-7 HHV-8
例如・・・
食品领域
・食物中毒致病菌的检测 ・食品的卫生管理 ・食物中毒的防止
临床领域
・病原菌・病毒的检测 及鉴定 ・通过SNP多态性分型 决定用药量
农业领域
・植物病害的早期发 现及蔓延防止 ・转基因作物的检测
环境领域
・环境、水中病原微生物 的检测
工业领域
・工业产品用大量 DNA的生产成为可能
畜牧业领域
Calcein
Mg++ PPi + Mn++
Mn2P2O7
－＋
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误区：染料采用SYBR Green I
反应前加入：抑制LAMP反应 反应后加入：违背了LAMP不开盖原则 SYBR Green I染料灵敏度高，20pg的DNA也能检测出， 不能特异性地指示LAMP产物
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实验室方法建立阶段
• 感染症以外应用
胃癌微转移术中快速诊断
• H.pylori • 真菌
（PubMed检索 keyword「LAMP isothermal amplification」）
进行引物设计，确立LAMP法检测体系→学会报告、论文发表
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LAMP法试剂盒产品
★细菌・原生动物
环境卫生检查用
Loopamp 军团菌检测试剂盒E （公定法収載） Loopamp クリプトスポリジウム检测试剂盒 Loopamp ジアルジア检测试剂盒
•Loopamp® 军团菌检测试剂盒C
离心后放入仪器 62.5℃ 35分钟反应
判定结果
通过浊度上升判断
观察荧光
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小结：
扩增反应在等温条件（60～65℃）下连续进行
⇒ 可以使用简便、廉价的扩增装置
扩增效率高、可在短时间内完成扩增
⇒ 可在短时间内得出结果