敏感（S)
剂量依赖性敏感 （SDD) 耐药（R)
>=19
15-18
<=8
16-32
<=14
>=64
S＝Susceptible SDD=Susceptible－Dose Dependent R=Resistant
酵母菌纸片扩散法敏感试验 NCCLS M44-P. 2003
氟康唑对标准菌株 24h抑菌环直径（mm)的质控允许范围
4.建议目前用Rosco纸片
5.寄希望将来推行Etest 法
标准菌株
氟康唑25ug
沃尔康唑1ug
31-42 28-37 － 16-25
白念珠菌 ATCC90028 近平滑念珠菌 ATCC22019 热带念珠菌 ATCC750 克柔念珠菌 ATCC6258
28-39
22-33 26-37 －
ROSCO纸片扩散法
ROSCO纸片扩散法： 1. 克柔念珠菌： 0.5麦氏浊度，生理盐水1：10稀释 菌液为5×105CFU/ml 2. 隐球菌属： 1 麦氏浊度 3. 其它酵母菌： 0.5麦氏浊度，生理盐水1：1稀释 菌液为2.5×106CFU/ml 将稀释好的菌液涂布在改良的SHADOMY（ PH7.0）培
养基上

其它操作同细菌。
Rosco纸片扩散法药敏结果判定
读取抑菌环直径近似到mm 在大约80%抑制区为测量边界 在抑菌环内个别细小或中等大小的菌落， <15可 忽略不计

两种纸片扩散法的比较

Rosco纸片扩散法 检测菌种 念珠菌属，隐球菌属 培养基 改良SHADOMY琼脂，PH7.0
缺点：1.价格太高
每片40-50元
2. 吡咯类MIC终点不好确定
酵母菌纸片扩散法敏感试验 NCCLS M44-P. 2003
培养基： Mueller-Hinton琼脂 补充 2％ Glucose 0.5ug/ml Methylene blue dye PH7.2-7.4
优点：有较好的重复性和稳定性 操作简便，价廉 缺点：目前只限氟康唑
35 ℃
新型隐球菌72小时 ， 其余菌株 48小时读取MIC结果
200ul菌悬液
酵母菌的NCCLS M27-A各药物折点
粘膜及系统性感染： 氟康唑（除克柔念珠菌）

敏感： 中介： 耐药： 敏感： 中介： 耐药：
≤ 8µg/ml － ≥64µg/ml ≤0.125µg/ml － ≥1µg/ml
NCCLS纸片扩散法 检测菌种 念珠菌属，隐球菌属 培养基 Mueller-Hinton 琼脂中补充2% 的 葡萄糖和0.5μg/ml的美蓝 试验药品及剂量 FLA 25µg 接种的菌量 1 ～5×106/mL 隐球菌 1.0麦氏浊度

Rosco纸片扩散法各药物折点
粘膜酵母菌感染
氟康唑 ，克霉唑，酮康唑，氟胞嘧啶1ug ，特比奈吩，咪 康唑等 敏感：≥20mm 中介 ：12~19mm 耐药：≤11mm 两性霉素B， 制霉菌素 伊曲康唑 敏感：≥15mm 中介：10~14mm 耐药：无抑菌环 氟胞嘧啶10ug 敏感： ≥30mm 用于黑曲霉 中介：23~29mm 耐药：≤22mm 灰黄霉素 敏感：≥10mm 中介：－ 耐药：无抑菌环
1.8ml1640
念珠菌属 35 ℃孵育48小时 新型隐球菌 72小时 读取MIC结果
常量稀释法
药敏结果判定
氟康唑，伊曲康唑，两性霉素为100%抑制 其他唑类药物为80%抑制
（取0.2ml的生长对照菌液加入0.8mlRPMI液体培养基的菌液浓度）
质控株
克柔念珠菌ATCC 6258 近平滑念珠菌ATCC 22019 白念珠菌ATCC 90028 白念珠菌ATCC 24433
真菌体外药敏用培养基

常量肉汤和微量肉汤法RPMI1640液制备：
RPMI 10.4g MOPS（三氮吗啡啉丙磺酸） 34.53 g 蒸馏水900ml溶解后，用1M NaOH调节PH至7.0（25℃）， 用蒸馏水溶至 1000ml， 高压灭菌后，冷却至50 ℃ 加入RPMI1640用0.22µm滤膜抽滤除菌，4℃保存。
菌悬液均匀涂布于药敏板上
35 ℃培养24小时读取结果 光滑念珠菌 新型隐球菌 等生长较慢的菌种需适当延长培养时间。
E-test法评价
准确性高,且操作简便 E-test法得到的MIC值在某些菌种中要低于NCCLS
推荐的常量肉汤稀释法测得的MIC 20%浓度CO2的环境中，可使此方法的结果更真实 反映药物对致病菌的敏感性
微量肉汤法
氟康唑的稀释方法同常量法，但起始浓度为2×常量法的
浓度（即128µg/ml ），终浓度为0.25µg/ml 。
氟康唑：1-10孔分别为 100ul 菌悬液：1-10孔分别为 100ul
。37℃ 。37℃ 64 32 16 8 4 2 1 .5 .25 .125 ＋ － 200ulRPMI汤
Rosco纸片扩散法各药物折点
系统性酵母菌感染
氟康唑15ug
18-24h
≤4 8-16 ≥32
敏感：≥30mm 中介：29~23mm 耐药：≤22mm
伊曲康唑 8ug
18-24h
≤0.06 0.125 ≥0.25
敏感：≥20mm
中介：19~12mm 耐药：≤11mm
这个MIC标准为纸片法的相应值
氟胞嘧啶1ug
敏感：≥20mm 中介：12-19 耐药： ≤ 11mm
氟胞嘧啶10ug
用于黑曲霉
敏感：≥30mm 中介：23-29 耐药： ≤ 22mm
氟康唑氟孢嘧啶 两性霉素B
制霉菌素
克霉唑-
伊曲康唑
特比奈酚
结论
1.常量稀释法难以推广
2.微量板浪费 3.NCCLS纸片法只做氟康唑
真菌常用的体外药敏试验 方法比较
真菌药敏试验临床难以开展的原因
1.按照NCCLS推荐的稀释法,操作繁琐 2.有些药只能用于某种菌的抗菌活性测定 3.纸片法试验未得到NCCLS 认可 4.E试验价钱太贵 5.药敏孵育时间因菌种而不同
体外敏感试验与临床治疗相关性
真菌体外药敏试验结果与口咽部真菌感染结果相关
粘膜感染： 伊曲康唑

粘膜及系统性感染： 5-氟嘧啶

敏感：
中介： 耐药：
≤4µg/ml
8~16µg/ml ≥32µg/ml
酵母菌E-test法
瑞典AB Biodisk MIC 优点：有较好的重复性和稳定性
E-test法
0.5麦氏比浊液 （约为1~5×106CFU/ml）。
Rosco纸片扩散法各药物折点
系统性酵母菌感染
酮康唑 15ug
敏感：≥30mm 中介：23-29 耐药： ≤ 22mm
纸片和培养基广州乐通公司可供应
≤0.12 0.25 ≥ 0.5
两性霉素 10ug
敏感：≥15mm 中介：14-10 耐药： ≤ 9mm
≤1 2 ≥4 ≤4 8-16 ≥ 32 ≤4 8-16 ≥ 32
菌液制备
将受试菌在沙保罗培养基上转种，以保证其纯度和活性。用0.85%的盐 水制成酵母菌悬液，调整其浊度达到0.5麦氏比浊标准（约为 1~5×106CFU/ml）。 常量稀释法：用RPMI1640液体稀释2000倍 接种浓度约为0.5~2.5×103CFU/ml 微量稀释法：用RPMI1640液体稀释1000倍 接种浓度约为1～5×103CFU/ml E-test法和NCCLS纸片扩散法：用菌液浊度为0.5麦氏单位。 Rosco纸片扩散法： 1. 念珠菌： 0.5麦氏浊度，生理盐水1：10稀(1~5×105CFU/ml) 2. 隐球菌属： 1.0麦氏浊度 3. 其它酵母菌： 0.5麦氏浊度，生理盐水1：1稀释




试验药品及剂量 AMB 10µg，IT 8µg， FLA 15µg，FC 1，10µg， FC 10µg ，KET15µg 等 接种的菌量： 5×105CFU/ml （克柔念珠菌先制成 0.5麦氏浊度，再用生理盐水1：10 。 隐球菌属配 1.0麦氏不稀释）其它菌种配0.5麦氏浊度， 1：1 稀释 培养条件 35 ℃孵育18～24小时 培养条件 念珠菌属35℃培养18~24小时， 新型隐球菌培养42~48小时 新型隐球菌30℃培养42~48小时 结果判读 FC及AMB100%被抑制， 结果判读 FC及AMB100%被抑制 唑类药物80%抑制 质控株 白念珠菌ATCC90028 唑类药物80%抑制 近平滑念珠菌ATCC22019 质控株 光滑念珠菌2238NL 白念珠菌ATCC64548 白念珠菌ATCC64550
真菌体外药敏用培养基

E-test法 ：
在RPMI液体培养基中补充葡萄糖，使其终浓度为2%。
NCCLS纸片扩散法 ： Mueller-Hinton 琼脂 补充2%葡萄糖和0.5μg/ml美蓝 丹麦ROSCO纸片扩散法 ： 改良的SHADOMY（ PH7.0）培养基 主要成分：酵母粉，葡萄糖，天冬氨酸，磷酸缓冲液等。
性好 对于深部的真菌感染，抗真菌药物敏感性试验同临 床治疗的相关性还有待进一步证实 体外敏感试验没有考虑到真菌对抗真菌药物在体内 的动力学和复杂的生物学作用
真菌体外药物敏感试验方法

NCCLSM27-A：常量肉汤稀释法，微量肉汤稀释法 E-test法 NCCLS M44-P纸片扩散法 (仅限氟康唑) 丹麦Rosco纸片扩散法(NCCLS未认可)
NCCLS纸片扩散法
0.5麦氏比浊标准（约为1~5×106CFU/ml）。



菌悬液均匀涂布于药敏板上 步骤同细菌敏感试验操作一致， 35～37℃孵育18～24小时， 对于生长缓慢的菌株如新型隐球菌，菌液需 调至 1麦氏单位，孵育48小时， 光滑念珠菌也需孵育48小时读取抑菌环直径。