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实验三
微生物的染色
一. 目的
1. 学习微生物的染色技术，掌握微生物的 单染色法和革兰氏染色法。 2. 学习油镜的操作。
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二．染色原理和油镜的工作原理
1．油镜工作原理
油镜的放大倍数最大（100），故镜头焦距短，直 径小,但所需光照强度却最大。从标本片透过的光线 是从玻片进入空 气，再进入镜头。由于玻璃和空气 的介质密度不同，有些光会 因折射或反射而 不能进入 镜头。物象就显 现不清。 为了不使通过的 光线有 所损失，须在油镜与玻片 之间加入折射率和玻璃 (n=1.52）相仿的香柏油 (n=1.515)。故而称之为 “油镜”。
二. 实验器材
1. 2. 3. 4. 活性污泥混合液。 单胞藻、新月藻、草履虫等示范片。 显微镜、载玻片、盖玻片。 目测微尺、物测微尺。
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三. 实验内容
1. 微生物大小的测定 (1) 标定目镜测微尺 装在目镜上的目测微尺中央刻有等分为 100 格 或更多格的标尺，使用前要用物测微尺标定。物测 微尺中央刻有1mm长的标尺，等分为100格，10μ m ／格。将物测微尺的刻度朝上放在载物台上，用低 倍镜找出物测微尺的刻度，移动物测微尺使其第一 条线与目测微尺的第一条线重合，顺着刻度线找出 另一条重合线。算出低倍镜下目测微尺每格的长度。 换高倍镜用同样方法标定出高倍镜下目测微尺每格 的长度。
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显微镜放大倍数 = 目镜放大倍数 × 物镜放大倍数
物镜上的标识：
1 .25 (0.65、0.25) ↓
数值孔径
100(40、10） ↓
放大倍数
160 / 0.17 ↓ ↓
镜筒长 盖玻片厚度
N.A. = n﹒s i n α / 2 n — 玻片和物镜之间的折射率。 α — 光线最大射入角。 分辨率（最大可分辨距离）＝λ/ N.A. 数值孔径： λ—波长
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三. 实验内容 (一) 显微镜的构造和使用方法 1. 构造 机械部分: 镜筒(双筒，两筒间距离可调，上装有目镜） 转换器（3孔，装有物镜） 载物台（中央圆孔、弹簧夹、移动器） 调节器（粗调、细调） 镜臂（支撑作用） 镜座（上有光源，亮度可调） 光学部分：目镜（10×、16×） 物镜（低倍镜10×、高倍镜40×、油镜100×） 聚光器（内有光圈调节） 光源（光量可调）
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测 微 尺 示 意 图
(2) 微生物大小的测量 将物测微尺取下，换上标本片，选择适当物 镜测量微生物的长度和宽度占目测微尺的格数，再 按目测微尺1格的长度算出微生物的长度和宽度。
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2.压滴法观察活性污泥中生物相
（1）压滴法制作标本片 用滴管取活性污泥混合液一小滴，放在 载玻片中央。取一块盖玻片先将一边与混合 液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在混 合液上。片内不能有气泡。 （2）观察活性污泥中生物相 先用低倍镜观察活性污泥中菌胶团、原 生动物、后生动物。画出所观察到的生物形 态图。标明名称、放大倍数和微生物的大小。
微生物实验

实验一 显微镜的使用及微生物形态观察 实验二 活性污泥生物相及藻类形态观察


实验三 微生物的染色
实验四 微生物细胞数的计数

实验五活性污泥不同微生物种群的分离培养 与鉴别
实验一 显微镜的使用及微生物形态观察
一. 目的 1. 了解普通光学显微镜的构造，学习显微 镜的使用方法和保养。（高、低倍镜的使用） 2. 观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的 个体形态，学会生物图的绘制。 二. 实验器材 1. 光学显微镜 2. 示范片：颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、 放线菌。
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3. 观察几种藻类的个体形态
观察几种藻类的个体形态，画出生物形态图， 标明名称、放大倍数。 四.实验结果 1.低、高倍镜下目测微尺每格的长度。 2.画出2~3种污泥中所观察到的生物形态图。 标明名称、放大倍数和微生物的大小。 3.画出两种藻类生物形态图，标明名称、放大 倍数和微生物的大小。 。
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（二）微生物形态的观察
1. 用低倍镜和高倍镜观察颤藻、 曲霉、青霉、酵母菌、放线菌、 星藻示范片。 2. 画出微生物形态图，并标明 显微镜的放大倍数。10╳ຫໍສະໝຸດ 10颤藻1-6
实验二 活性污泥生物相的观察 一. 目的
1.学习测量微生物大小。 2.学习用压滴法制作标本片。 3. 观察几种原、后生动物，菌胶团及藻类个体形态。
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2. 显微镜的使用 低倍镜的使用
（1）双手取出显微镜置于实验台上，接上电源，打开开 关，调节合适光量。 （2）转动转换器，将低倍镜移至正下方。调节两目镜镜 筒间的距离。 （3）将载玻片放在载物台上夹住，移动观察对象于圆孔 正中。 （4）侧视物镜，转动粗调将载物台上移，至载玻片距物 镜头约５ｍｍ时停止。 （5）双眼向目镜里观察，同时旋转粗调节器使载物台缓 慢下移，若标本显出但不清晰，可用细调节器调至清晰。若 粗调旋转太快，超过焦点没有看到标本，则必须重复（4）、 (5)步骤。不能在眼睛观察目镜的同时旋转粗调，以防物镜与 载玻片相碰撞，造成损坏。
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高倍镜的使用
在用低倍镜找到观察目标后，若需要进一步放大观察，
将其移到视野中央。用转换器将高倍镜移到镜筒下方，将光
量调大一点。若标本不清晰，用细调上下转动使之清晰。 （此时不再动粗调）
３．显微镜的维护
（１）将载物台降至最低，取下标本片。
（２）将光量调至最小，关上电源。
（３）用镜头纸先檫目镜、物镜，再擦显微镜其它部分。 （４）将显微镜放入镜箱，还原。
易与带负电荷的菌体结合使之着色。经染色后的
菌体细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下很
容易观察。
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3．革兰氏染色法：
革兰氏染色法将细菌分为 G＋ 和 G- ，这由两类细菌细胞 壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细 菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫 - 碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处 理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G ＋ 细菌的细胞壁主 要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用 乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低， 使得结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经 洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由于 其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时， 类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的复 合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复 染剂的颜色。 3-3
2．单染色法：
微生物不但个体微小，且无色半透明。要在显 微镜下观察清楚，必须染上颜色 。微生物细胞中
含有大量的蛋白质等一类两性电解质：在酸性溶
液中结合质子带正电；在碱性溶液中给出质子而
带负电。等电点一般在 pH=2~5。所以，在中性、
碱性或弱酸性溶液中，微生物细胞通常带负电荷。 碱性染料在电离时，染色部分是带正电荷的，容