第29卷第3期佛山科学技术学院学报(自然科学版)V o l.29N o.3 2011年5月 Jou rnal of Fo shan U n iversity(N atu ral Science Editi on)M ay2011文章编号:100820171(2011)0320065203黄嘌呤氧化酶法优化大鼠血清SOD测定条件的探讨翁闪凡,张晓林(佛山科学技术学院检药系,广东佛山528000)摘要:目的 优化黄嘌呤氧化酶法测定大鼠血清SOD实验条件。
方法 采用黄嘌呤氧化酶法,探讨其加样量、方法重复性、显色稳定性、试剂稳定性及样品稳定性等最佳因素。
结果 黄嘌呤氧化酶法测定大鼠血清SOD最佳加样量为5Λl,其测定变异系数CV<1%,显色前后20m in吸光度比较(P>0.05);新配试剂与配制3个月试剂做测定,吸光度比较(P<0.01);新鲜标本和4°C放置48h标本进行测定,吸光度比较(P<0.01)。
结论 黄嘌呤氧化酶法测定大鼠血清SOD最佳加样量为5Λl,该法重复性好,显色稳定,测定试剂必须新鲜配制,标本必须新鲜制备。
关键词:黄嘌呤氧化酶法;SOD;测定中图分类号:R446.112 文献标志码:A自由基作为引起机体组织细胞损伤的重要因素,引起多种疾病发生、发展,日趋受到国内外医学界的认可及重视。
超氧化物阴离子是人类机体内重要的自由基,对机体有很大的损伤作用,超氧化物歧化酶(Sup erox ide dis m u tase,SOD)是广泛存在于各类生物体内的酸性金属酶,催化生物体内超氧自由基(O-2)发生歧化反应,是机体内O-2的天然消除剂,对机体细胞起保护作用。
近年来对抗氧化的动物实验研究越来越多,因此建立SOD活性的测定方法,并对其进行方法学探讨显得尤为重要。
目前,SOD活性测定主要有黄嘌呤氧化酶法、邻苯三酚自氧化法、羟胺发色法、四氮唑蓝(NB T)显色法、化学发光法[1],笔者主要对黄嘌呤氧化酶法测定大鼠血清SOD进行方法学探讨。
SOD测定试剂盒(南京建成生物工程研究所提供,批号:20100107);722分光光度计;微量加样器;吸嘴;试管。
1 实验原理通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生的超氧阴离子自由基(O-2),后者氧化羟胺形成亚硝酸盐,在显色剂的作用下呈现紫红色,用可见分光光度计检测其吸光度。
当被测样品中含SOD时,则对超氧阴离子自由基(O-2)有专一性抑制作用,使形成的亚硝酸盐减少,比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值,通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。
2 实验方法及结果2.1 加样量2.1.1 方法 取大鼠新鲜血清20例,将加样量分为3Λl、4Λl、5Λl、6Λl4组,根据说明书中提供的抑制率参考范围收稿日期:2011203229基金项目:广东省自然科学基金资助项目(7010421)作者简介:翁闪凡(19752),女,广东佛山人,佛山科学技术学院讲师。
为48%～55%,确定最佳加样量。
抑制率=(对照管吸光度-测定管吸光度) 对照管吸光度。
2.1.2 结果结果见表1。
表1 大鼠血清SOD活力测定加样量组别3Λl4Λl5Λl6Λl 抑制率 %(x±s)18.35±0.9125.51±1.4351.40±1.9660.12±3.45 结果表明,最佳加样量为5Λl。
2.2 重复性取20例大鼠血清3平行测定,结果吸光度(A)为0.475±0.001,变异系数(CV,%)为0.077±0.087,由此可见,其变异系数(CV)<1%,该法重复性很好,精密度高。
2.3 显色稳定性2.3.1 方法取新鲜样本20例,分显色组与显色20m in组来测定其吸光度,做t检验。
2.3.2 结果结果见表2。
结果表明:显色组与显色20m in组其吸光度(A)比较P>0.05,两组无显著性差别,该法显色稳定性较好。
2.4 试剂稳定性2.4.1 方法将新鲜试剂和存放3个月的试剂(旧试剂)分成两组,大鼠新鲜血清测定其吸光度(A),做t检验,得出P值。
2.4.2 结果结果见表3。
结果表明:新鲜试剂组与旧试剂组吸光度(A)比较P<0.01,两组有显著性差别,表明该法测定试剂必须新鲜配置。
表2 大鼠血清SOD活力测定显色稳定性组别吸光度显色组0.470±0.112显色20m in组0.484±0.107 P值0.889表3 大鼠血清SOD活力测定试剂稳定性组别吸光度新鲜试剂组0.53±0.06旧试剂组0.61±0.01P值0.0082.5 样本稳定性2.5.1 方法取大鼠新鲜血清20例,分新鲜血清组和4°C放置48h血清组(大鼠陈旧血清组)两组,测定其吸光度值(A),做t检验,得出P值。
2.5.2 结果结果见表4。
结果表明:大鼠新鲜血清组和大鼠陈旧血清组吸光度(A)比较P<0.01,两组有显著性差别,表明测定标本必须新鲜,否则对测定影响很大。
表4 大鼠血清SOD活力测定样本稳定性组别吸光度大鼠新鲜血清组0.50±0.11大鼠陈旧血清组0.30±0.06P值0.003 讨论SOD有胞浆的铜锌SOD(Cu,Zn2SOD),线粒体内的锰SOD(M n2SOD),胞外的SOD(EC2SOD)3种[2],作为生物机体抗氧化酶系统中重要的抗氧化酶之一,SOD是生物体内重要的超氧阴离子自由基清除剂,其主要作用是能专一地清除生物氧化中产生的超氧阴离子自由基,有助于减少和阻止脂质的过氧化反应,延缓机体衰老及防止生物大分子损伤。
目前研究发现,SOD与呼吸系统、循环系统、消化系66佛山科学技术学院学报(自然科学版) 第29卷统、精神系统疾病及肿瘤有很大关系,其含量随病情变化而变化,动态监测SOD 含量对了解疾病的发病机制、病情、转归、预后以及临床治疗有重要的意义[3]。
目前,许多药物临床前研究、疾病发病机制等动物实验研究都需要测定SOD 活性,通过其活性来反映药物的抗氧化作用和阐明疾病的发病机制等相关信息。
由于大鼠的生理及遗传特性,大多数研究使用的实验动物为大鼠,因此有必要对大鼠血清SOD 测定的方法学进行探讨。
笔者经过一系列实验,结果表明,黄嘌呤氧化酶法可以很好地测定大鼠血清SOD 活性,其最佳加样量为5Λl ,其抑制率随着加样量的增加而相应升高,而加样量5Λl 抑制率全部落在反应曲线平坦部分;黄嘌呤氧化酶法由于其方法学为稳定的化学显色反应,其吸光度稳定性好,在保证操作者操作及实验环境的稳定性前提下,其平行操作的吸光度稳定,重复性好,显色稳定,结果精密度高。
该方法在标本处理问题上,血清标本贮存的条件对测定结果影响很大,建议标本存放在-20°C 最佳[4]。
标本随贮存期的延长其SOD 活力呈下降趋势[5],所以标本必须新鲜制备及检测更好。
该方法测定的试剂必须新鲜配制,尤其是显色剂更容易变红,最好是临用前配制。
参考文献:[1] 黎瑞珍,杨庆建,陈贻锐.超氧化物歧化酶(SOD )活性的测定及其应用研究[J ].琼州大学学报,2004,11(5):34236.[2] 谢继青,李玉华,杨春梅,等.超氧化物歧化酶的药理作用[J ].中国生化药物杂志,2009,30(1):72275.[3] 李长荣,姜军作,衣运玲.超氧化物歧化酶与疾病关系的探讨[J ].医学与哲学:临床决策论坛版,2007,10(28):43244.[4] 张娟,曾志将.不同贮存温度和时间对蜂王浆中SOD 活性的影响[J ].蜜蜂杂志,2008(7):627.[5] 蒋皎亮.105例血浆SOD 活力观察[J ].包头医学院学报,2003,19(3):178.【责任编辑:邓军文 dengjunw en 69@ 】The m ea surem en t ofseru m S OD xan th i ne ox ida se cond ition sW EN G Shan 2fan ,ZHAN G X iao 2lin(Schoo l of M edicine ,Fo shan U niversity ,Fo shan 528000,Ch ina )Abstract :Objective To op ti m ize the m easu rem en t of the serum SOD under the xan th ine ox idase exp eri m en tal conditi on s .M ethod to u se xan th ine ox idase to exp lo re the op ti m al facto rs such as the am oun t of the added sam p le ,m ethod rep roducib ility ,co lo r stab ility ,reagen t stab ility and sam p le stab ility fo r the m easu rem en t .Result T he op ti m al vo lum e of SOD w as 5Λl ,the coefficien t ofvariati on w as CV <1%and the co lo r ab so rbance w as P <0.05%20m inu tes befo re and after the test .Com pared w ith 32m on th reagen ts ,the new one w as found to have a co lo r ab so rbance of P <0.01and the co lo r ab so rbance w as P <0.01%w hen the new reagen t w as sto red at 4°C fo r 48h .Conclusion T he op ti m al sam p le vo lum e w as 5Λl w hen xan th ine ox idase w as u sed to m easu re serum SOD ,w h ich is of good rep roducib ility w ith a co lo r stab ility .T he reagen t and the speci m en s are bo th suggested to be fresh ly p repared .Key words :xan th ine ox idase ;SOD ;deter m inati on76第3期 翁闪凡等:黄嘌呤氧化酶法优化大鼠血清SOD 测定条件的探讨。