XX大学本科生毕业论文（设计）开题报告毕业论文（设计）题目应用原生质体融合技术构建耐胆盐、耐酸乳酸菌菌株选题类型应用基础型课题来源自选项目学院生命科学与理学院专业生物科学指导教师×××职称××姓名×××年级2006级学号×××开题报告（立题依据、研究的主要内容及预期目标、研究方案、论文进度安排、主要参考文献）1立题依据2一、选题的理论意义与实践意义：3选题理论意义: 黄瓜（Cucumis sativus Linn）是我国广泛栽培的夏秋季主要蔬菜之一。
它喜温怕热，在胁迫因子当中，夏季高温是影响黄瓜幼苗地上部分生长发育的主要因子，露地和保护地栽培均存在高温热害，高温影响黄瓜的光合作用、呼吸作用和矿质元素的吸收，从而易使黄瓜授粉受精失败，落花落果，严重影响了黄瓜的产量和品质，因此黄瓜耐热性的提高是露地及保护地栽培需要解决的重要问题。
4硒作为谷胱甘肽过氧化物酶系（GSH-Px）的组成成分，参与作物体内自由基的消除，进而提高了植物对逆境的抗性，硒的使用可显著提高黄瓜叶片GSH-Px 的活性，使叶片中丙二醛(MDA)的含量明显降低。
高温胁迫下，硒还能中和与衰老相关的氧化胁迫。
5实践意义：高温胁迫使黄瓜的品质下降，严重影响栽培设施的利用效率及黄瓜设施栽培的高效可持续发展。
因此，研究硒对高温胁迫黄瓜幼苗地上部的生长调节，可以采取有效措施，对于黄瓜设施生产具有重要意义牛奶的组成最为接近人体母乳，含有人体所需的全部营养成分，营养最为丰富和均衡，在人们的膳食结构中有其它食品无法替代的地位和作用。
由新鲜牛奶发酵成的酸奶由于其丰富的营养、特殊的风味、爽滑的质构和良好的生理功能，倍受人们青睐[1]。
在当今社会，酸奶早已成为人们茶余饭后的饮料，酸奶所具有的独特功效备受人们喜爱。
1908年俄国诺贝尔奖获得者E．Metchnikof提出“酸奶长寿”理论，认为高加索地区居民长寿者多的原因是由于食用大量的含有乳酸菌的酸奶。
乳酸菌是一类可以发酵碳水化合物产生乳酸的细菌的统称，很早就被用来加工和保存食品，不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，提高食品保藏性和附加值，而且近年来对乳酸菌的研究表明，乳酸菌还有很多特殊的医疗保健作用，如改善胃肠道功能，提高免疫力，维持维生素供应，降低胆固醇，美容，长寿，降血糖等，益生作用突出[2-4]。
另外，乳酸菌能产生一系列具有抗菌活性的有机小分子物质，常见的有乳酸、乙酸、丙酸。
除了这些具有抑菌作用的初级代谢产物外，益生乳酸菌还产生如细菌素等多种抗菌物质，其中酸性物质和乳酸菌素是最有效的抑菌物质，并通过减少肠道中有毒物质的形成，来帮助人们的延年益寿。
人类的肠道拥有一个丰富而有活力的菌群，至少含有400～500种细菌，益生菌是通过维持或改善肠道菌群平衡而对消费人群具有确实的保健功能的活菌制剂。
然而人体胃环境的低pH（有时pH值小于3）下，不利于微生物的生长；同时胆汁进入小肠，也大大影响肠道微生物的生长繁殖。
研究发现，酸奶中的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在摄入消化道中后，经受不住强烈的胃酸和胆汁的强烈作用，不能在人体肠道内固定下来和生存增殖。
口服乳酸菌若要到达肠道并在肠道内起作用，需要菌体或菌体产生的酶能够通过低pH胃液存活下来，耐受肠道内的胆盐浓度[5]。
因此要求具有一定耐受胆盐、耐受酸度使乳酸菌能够活着到达作用位点，而且它还必须能通过上消化道，并能在肠道中的环境中发挥积极作用[6]；而且益生性乳酸菌可用于治疗肠道菌群失调，以及消化道的通透性增加等症状，而后者是许多肠道失控的主要特征[7]。
所以如何构建耐受胆盐和耐受低pH的酸奶发酵剂，是提高酸奶营养价值被机体吸收利用的关键，成为当前研究的重要方向。
近年来，由于乳酸杆菌具有转化率高、产酸快和基因工程可操作性而广泛用于乳酸发酵生产。
尤其是基因组洗牌分子技术，此技术是DNA shuffling技术的一个改进，通过改变乳酸菌基因组原有的核苷酸序列，产生新的遗传结构，创造新的基因，并赋予表达产物以新的功能[8]。
目前国内外也做了很多这方面的研究。
微生物原生质体融合技术的整个过程包括：原生质体的制备、原生质体融合、原生质体再生。
国内外学者在每一个关键技术上都做了大量的工作，取得了可喜的成就[9]。
并在工业生产中大量应用，尤其是微生物育种方面应用最为广泛。
2 研究的主要内容及预期目标原生质体融合技术是构建多突变组合微生物的有效工具，可以在短时间内获得多亲本的良好的菌株性状(耐受胆盐、耐受pH 特性、快速产酸特性、细菌素产生、良好的风味)的遗传基因的重组菌株，每次原生质体融合都能获得一些有用的遗传多样性，对乳酸菌的育种具有重要意义。
进行原生质体融合时，先用酶脱去两个亲本细胞壁，使菌体细胞在高渗环境中释放原生质体，并在高渗条件下混合，再经聚乙二醇促进，两种原生质体凝集而发生融合，获得异核体或重组子。
利用杂合菌可以提高发酵制品的特性或发展新的产品[1]。
将从酸奶和牛场中分离筛选具有一定的pH 和胆盐耐受特性的6株乳酸菌进行原生质体的融合，构建耐受高胆盐浓度和低酸度的优良菌株。
在整个实验中，探讨原生质体制备的最优方案成为一个难点，包括菌株预处理时间，酶解条件等；以及用通过互补致死损伤进行原生质体灭活的方案，作为原生质体融合的标记是一个重点；关于原生质体的融合的再生条件是本实验的关键。
必须准确把握每个步骤，达到预期目的。
3 研究方案3.1 实验流程3.2 实验材料 3.2.1 实验材料样品及其来源：从牛奶和牛场环境中筛选出6株具有一定耐胆盐和耐酸乳酸菌菌株 1.0ug/ml 青霉素MRS 预处理4h0.6%Gly +0.5ug/ml 青霉素液体MRS 预处理4h1.2%Gly 液体MRS 预处理4h原生质体高温灭活原生质体紫外线灭活 2mg/ml 溶菌酶酶解1.0-2.0h耐性筛选原生质体的融合再生培养液体MRS 活化菌株、370C 过夜培养PEG6000，溶菌酶 3.2.2 培养基与溶液配制MRS 液体培养基：蛋白胨10克，牛肉浸取物10克，酵母提取液5克，葡萄糖5克，乙酸钠5克，柠檬酸二胺2克，吐温801ml ，磷酸氢二钾2克，四水硫酸锰0.25克，七水硫酸镁0.58克，蒸馏水1升。
固体培养基琼脂20.0克(进口的15克)，蒸馏水定容至1.0升；半固体MRS 培养基，加0.9%琼脂和1%的氯化钙。
再生培养基：不含吐温80的液体MRS ，明胶2.5%，氯化镁25mmol/L,氯化钙25mmol/L ，蔗糖0.5mol/L ，小牛血清0.5%。
选择培养基：在液体MRS 基础上调节pH1、pH2、pH3;添加牛胆盐1%、2%、3%。
LBP 缓冲液：Tris-HCl 10mmol/L, 氯化钙20mmol/L ，蔗糖0.5mol/L,pH6.3 40％聚乙二醇PEG6000溶液用灭菌高渗缓冲液配制，溶菌酶储液用TE 配置。
3.2.3 实验设备与仪器高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，生化培养箱，紫外可见分光光度计、电子天平 3.3 实验步骤 3.3.1 原生质体制备 3.3.1.1 菌种活化将实验室所保存的来自酸奶和牛场的具有一定的耐受胆盐和耐受酸度的乳酸菌，转接于MRS 培养基中37℃中过夜培养，进行菌株活化（图1）。
3.3.1.2 菌株前处理每几株菌过夜培养后新鲜菌液按2%一起接种于5ml 分别含1.0%甘氨酸、1mg/ml 青霉素、0.5%甘氨酸+0.5mg/ml 青霉素MRS 液体培养基37℃振荡培养4h （图2）。
A B FC D E 图1 MRS 液体培养基，37℃过夜培养10～12h ，进行菌株活化3.3.1.3 制备原生质体悬液取1ml 混合培养菌液，离心收集菌体，高渗缓冲液洗涤2次，重悬于高渗缓冲液中，甘氨酸和青霉素预处理的菌体分别添加终浓度为2mg/ml 溶菌酶，37℃保温1.0～2.0h ，显微镜下观察破壁情况。
酶解后当90％以上菌体破壁时，3000r/min 离心10min ，再用高渗缓冲液洗涤2次，重悬于50ul 高渗缓冲液中备用。
酶解条件如表1。
表1 各预处理下菌株酶解条件预处理条件 预处理 酶解 原生质体形成率1.2%Gly 4h 2h 1.0ug/ml 青霉素 4h 1h 1.2%Gly+0.5ug/ml 青霉素 4h1h3.3.2 原生质体灭活灭活的双亲原生质体只有通过融合后致死损伤得到互补才能形成融合子，因此采用能引起细胞不同部位的致死作用的热和紫外线灭活方法，热灭活的致死机理是细胞质中蛋白变性，紫外线灭活的机理是核酸(DNA)断裂所致。
利用原生质体互补致死灭活作为分子标记。
两亲株融合后，损伤可以互补，形成能够生长繁殖的融合子。
基因组改组技术应用多母本递进融合，定向筛选具有重要表型特征改变的突变体。
作为有效的工业微生物菌种改造技术，可以用于工业微生物复杂表型的改良[ 10-11]。
取悬于缓冲溶液中的1/2原生质体液60℃保温120min ，其余1/2紫外线下照射32min ，分别灭活。
原生质体灭活条件如表2。
ABC 1.2%Gly MRS DEF ABC DEF0.6%Gly+0.5ug/ml 青霉素ABC DEF 1.0ug/ml 青霉素MRS 图2 37℃培养4h 至对数期前期表2 原生质体灭活条件灭活技术作用部位灭活时间灭活率紫外线细胞核32min高温细胞质120min3.3.3 原生质体的融合将上述不同方法灭活原生质体混合，在3000r/min条件下离心10min，重悬于50ul高渗缓冲液中，加4.5ml 40％PEG6000，充分混匀，室温下放置6min，加5ml高渗缓冲液稀释PEG6000，终止反应，迅速在3000r/min条件下离心10min，然后洗涤2次，悬于100ul 高渗溶液中。
3.3.4 再生培养将高渗溶液中融合的原生质体转接于再生培养基，在倒好的MRS培养基表面将融合的原生质体涂布均匀，将冷却至50～60℃的再生半固体培养基倒在涂布有融合菌的平板中，37℃避光培养培养24～96小时，每隔一天观察记录融合子形成情况。
融合子形成数统计表如下表3表3 各处理下融合子形成数预处理条件 1.2%Gly 1.0ug/ml青霉素 1.2%Gly+0.5ug/ml青霉素融合子形成数3.3.5 耐受性筛选胆盐耐受性：将再生的融合菌分别转接于1%、2%、3%胆盐浓度的液体MRS培养基37℃培养4h,吸取筛选菌200ul涂布于MRS平板中，37℃培养24～48小时。
pH耐受性：将高胆盐浓度平板上的抗胆盐菌落分别转接到pH1、pH2和pH3的液体MRS 培养基中37℃培养4h后，吸取200ul涂布于MRS平板，37℃培养24～48小时。