荧光自吸收：
荧光荧光波长与激发光波长重叠时，荧光被吸收
二、激发光谱与发射光谱
激发光谱:固定发射波长(λEM),一般在最大发射位置
做If– λEX的光谱，既不同波长激发光所
产生荧光的相对效率。 做If– λEM的光谱，既最大吸收波长下产 生荧光的相对强度。
发射光谱:固定激发波长(λEx),一般在最大吸收位置
当I0一定并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
I f= K · C
K = 2.303 φ I0 kb)
Cmax≈0.05/kb 当C超过Cmax 时，If—C偏离线性 溶液浓度太大，荧光分子之间及荧光分子与溶剂分
子之间碰撞，发生非辐射跃迁，使荧光强度下降。
荧光自熄灭： C增大到一定程度，就会发生荧光自熄灭现象
5、能系间交叉跃迁
电子自旋被反转，使分子的多重性发生变化
6、磷光 从三重态最低振动能级回到基态，放出磷光。 二、影响荧光强度的因素 1、荧光效率（荧光量子产率Φ） 物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表
示：
Ff = 发射荧光的分子数 激发态的分子数
= 发射的光子数 吸收的光子数
光致发光（Photoluminescence）:
荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最 低振动能级回到基态所发出的辐射。 磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到 基态所发出的辐射。
回基态时的发光现象.
分子的多重态
单重态




优势。 1、振动驰豫 1）分子吸收光子后，可能被激发到激发态的各个 振动能级 2）通过碰撞（非辐射跃迁）到达同一激发态的最 低振动能级 需时间10-13—10-11sec，效率较高 2、荧光发射

Hale Waihona Puke 分子从单重激发态的最低振动能级发射光子回 到基态——荧光发射。 荧光光谱的波长比吸收光的波长大（长），这 种现象叫作红移或斯托克斯位移。 3、内部转换 1）分子内过程，热退激 2）两个激发态重叠的能级发生内转换，因此吸 收λ1、λ 2 两种波长的光后，都产生λ’ 2 的荧光。 4、外转换 激发态分子与溶剂或其它溶质间相互作用和能量 转换。
一个所有电子自旋都配对的分子的电子


状态。大多数有机物分子的基态是单重态。
当基态一对电子中的一个被激发到较高能 级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于 单重态。 有两个电子的自旋不配对而平行的状态。 激发三重态能量较激发单重态低。
三重态
一、分子退激发的过程 激发态分子回基态的途径很多，速度最快的途径占


4、检测器
光电倍增管
二、仪器光路
样品池 光源 激发单色器
发射单色器
检测器
第三节 荧光光谱法的基本参数及测量
一、荧光强度
根据朗伯-比尔定律
Ia=I0-I=I0(1-10-εbc)
则If=ΦfI0（1-10-kbc)=φI0(1-e-2.303k=bc) 对于稀溶液，kbc=A A＜0.05 If= 2.303 φf I0 kbc
机离子能与一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量测定.
生物化学及生理医学方面的应用
荧光法对于生物中许多重
要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用于生 物化学分析,生理医学和临床分析.
药物分析
荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱和高效毛细管
电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵敏度,高选择性的 测定方法结合起来,可用于测定复杂的混合物


3）pH值的影响
荧光物质的电离与非电离形式的Φf有差别，带 有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与 pH关； 4）溶解氧的影响 溶解氧的存在使Φf下降

第二节
荧光分光光度计
一、基本构造

1、光源
强度较高的氙灯或氙汞灯，要求有稳定的供电源。
2、单色器 两个，互成直角 3、样品池 四通杯
目的:找到λEXmax 和λEMmax
三、荧光分析法
直接荧光法：样品本身发荧光，直接测定其荧光强

度，按吸收定律计算样品浓度。
荧光物质）间接测定。 探测剂称为荧光探针
间接荧光法：样品本身不发荧光，通过探测剂（强
样品浓度的定量计算采用标准曲线法
四、荧光分析法的应用
无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多无
Φf与退激发过程的速率常数k有关
Ff =
k
f
kf + k i + k ec + k ic
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他退激发过程 （能系间交叉、外转换、内转换的速率常数减小的 因素都可使荧光增强。 Kf、Ki与分子结构有关，Kec、Kic与分子所处的环 境有关
高荧光分子Φf
1，无荧光分子Φf
0
2、影响荧光强度的因素


1）荧光与分子结构的关系
a、能吸收紫外可见光，有共轭双键，分子呈刚 性、平面、多环结构，而且共轭平面越大、π电子共 轭度越大， Φf越高。 b、取代基的影响 给电子基团使Φf增强，如-NH2、-OH 与π电子体系相互作用小的取代基对荧光影响小



高原子序数的原子引入π电子体系，使荧光减弱
吸电子基团，如：-COOH 、–NO2 、–N=O2、 卤素 刚性平面结构有利于荧光，因为刚性结构可以 减少分子振动，减少能系交叉和碰撞退激。 2）温度和溶剂效应 温度升高， Φf下降 溶液黏度下降， Φf下降 不能使用含有重原子的溶剂
使荧光熄灭。


溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧 光波长红移；若溶剂和荧光物质形成氢键或 使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、 荧光波长改变。
荧光团杂化纳米二氧化硅微球