第一节 外源基因在原核细胞中的表达
1.原核生物基因表达的特点
与真核细胞相比，原核细胞的基因表达有以下特点： （1）原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有三种）识别 原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 （2）原核生物的基因表达是以操纵子为单位的。 （3）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是 连续进行的。 （4）原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细 胞的转录后加工系统。 （5）原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对
根据转录终止作用类型，终止子可分为两种：依赖于ρ因子 的转录终止子及不依赖于ρ因子的转录终止子。
（3）S-D序列 S - D 序 列 是 位 于 起 始 密 码 子 （ A U G ） 上 游 3 ~10bp 处 的 由
3~9bp组成的序列。这段序列正好与16S rRNA 3’端序列互 补，是rRNA的识别和结合位点。
列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、增强子、衰减子等序 列。
（1）启动子
启动子(promoter)是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并 能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调 控序列。没有启动子，基因就不能转录。
原核生物的启动子是由两段彼此分开且高度保守的核苷酸序 列组成。
■-35区（TTGACA）：位于转录起始位点上游的-35bp附近， 是RNA聚合酶初始识别和结合位点。
基因产物的直接控制要慢。 （6）在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译 起始密码子及16S核糖体RNA 3’ 末端碱基互补的序列，即 S-D序列，而真核基因则缺乏此序列。
2.原核表达系统的注意事项
从上述特点可以看出，欲将外源基因在原核细胞中表达，必 须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和S-D 序列、阅读框架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须 满足以下条件： （1）通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的 酶系统合成外源蛋白。 （2）外源基因不能带有内含子，因而必须用cDNA或化学合
5.外源基因在大肠杆菌中的表达部位
（1）不同表达部位 克隆在大肠杆菌中的外源基因，它们的编码产物蛋白质，有
的是在细胞质中表达，有的是在细胞周质中表达，还有的则是 以分泌到细胞外的方式表达。 ■细胞质中表达
大肠杆菌细胞质中表达的外源蛋白，大多是以包含体的形式 存在的。包含体是存在于细胞质中的一种由不溶性蛋白质聚集 折叠而成的晶体结构。 ■周质中表达
的基因，而不能用基因组DNA。 （3）必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控 制外源基的表达。 （4）外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读 框架。 （5）利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外 源基因的表达产物对宿主菌的伤害。
3.原核生物基因表达的调控序列
只有在了解了原核生物基因表达调控序列的基础上， 才能够 构建高效的表达载体，使外源目的基因在原核细胞中得到高效 率、高水平地表达。对于原核细胞来讲，基因表达的调控序
周质是指在大肠杆菌一类格兰氏阴性细菌中，位于内膜和外 膜之间的细胞结构部分。周质中表达的蛋白需要在信号肽的引
导下才能穿越内膜，进入细胞周质。 ■细胞外表达
➢在编码序列的下游紧接着一段人工合成的多克隆位点片断， 包括三个单一酶切位点，Eco RI、Hind III、Bam HI。
（3）融合蛋白表达载体pGEX系统
载体的组成成分基本上与其它表达载体相似，含有启动子tac 及lac操纵基因、S-D序列、lacI阻遏蛋白基因等。
这类载体与其它表达载体不同之处在于S-D序列下游是谷胱 甘肽巯基转移酶基因，而克隆的外源基因则与谷胱甘肽巯基转 移酶基因相连。当进行基因表达时，表达产物为谷胱甘肽巯基 转移酶和目的基因产物的融合蛋白。
S-D序列存在与否及S-D序列与起始密码子之间的距离，是影 响mRNA翻译成蛋白质的主要因素之一。 （4）增强子
增强子（enhancer)是能够增强启动子转录活性的DNA顺式 作用序列。
4.几种类型的原核表达载体
在原核细胞中表达外源基因时，由于实验设计的不同，总的 来说可以产生融合型和非融合型表达蛋白。不与细菌的任何蛋 白或多肽融合在一起的表达蛋白称为非融合蛋白。融合蛋白指 蛋白质的N末端由原核DNA序列或其它DNA序列编码，C端 由真核DNA的完整序列编码。
这个载体系统是由pBR322为基础构建的。 ➢带有大肠杆菌最强的启动子之一，即Ipp（脂蛋白基因）启 动子。在启动子的下游装有laclac I）也克隆到这个质粒上。这样目 的基因的表达就成为可调节的了。 ➢在转录控制的下游再装上人工合成的高效翻译起始序列（SD序列及ATG）。 ➢信号肽序列取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompa（外膜 蛋白基因）。
■-10区（Pribnow框，TATAAT）：RNA聚合酶结合于此处 导致DNA双链形成单链。
原核表达系统中通常使用的可调控的强启动子有lac（乳糖启 动子）、trp（色氨酸启动子）、PL及PR（λ噬菌体左向和右 向启动子）、tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）等。
（2）终止子
在一个基因或一个操纵子的3’端往往有一个特定的核苷酸序 列，它有终止转录的功能，这一段DNA序列称为终止子 （terminator)。终止子在结构上有一些共同的特点，即有一 段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域，G/C区域具有回文 对称结构，使转录后的RNA具有茎环结构。
（1）非融合型表达蛋白载体pKK223-3
➢具有一个强的tac（trp-lac）启动子，这个启动子是由trp启 动子的-35区、lac UV5启动子的-10区、操纵基因及S-D序列 组成。
➢紧接着tac启动子的是一个取自pUC8的多位点接头，使之很 容易把目的基因定位在启动子和S-D序列之后。
➢在多位点下游的一段DNA序列中，还包含一个很强的rrnB 核糖体RNA的转录终止子。 ➢载体的其余部分由pBR322组成。 （2）分泌型克隆表达载体pIN III系统