chromosome chr2 chr2 chr2 chr2 chr2 chr2 chr2 chr2 chr2 chr2 chr2 chr2 chr2 chr2 chr2 chr2 chr2 chr2 chr2 chr2
gene_id
GO
AC199765.4_FG008 hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds GRMZM2G177273 dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase 67 kDasubunit，protein amino acid glycosylation，integral to membrane GRMZM2G002642 ankyrin-like protein，methyltransferase activity，antiporter/ drug transporter/ transporter GRMZM2G039845 DNA binding，ligand-dependent nuclear receptor activity，transporter activity，regulation of transcription, DNA-dependent GRMZM2G114149 binding，transmembrane transport GRMZM2G123122 transporter activity GRMZM2G127591 phosphoglycerate kinase activity，transmembrane transport
——TG**************GA——————TGTTATGCC—— ——TG**************GA——————TG********CC—— ——TGGAATCATGGA——————TG********CC——
图8 ZmCRP 5’UTP 区域的单倍型
二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析
突变体
野生型
叶肉细胞
茎韧皮部细胞
根韧皮部细胞
二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析
3、候选基因的精细定位与图位克隆——将控制玉米粒厚的主效
基因定位在120kb内
A B
图3 候选基因的初步定位 表2 目标区域内的候选基因
图4 候选基因的精细定位
4 万株定位群体，将候
选基因定位在 120kb 内，
甲基转移酶
Primer
B-8
B-11
Indel标记
二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析
5、候选基因的关联分析——确定目标基因的单倍型
在497份自交系中，该基因启动子区域有4种单倍型
5’UTR CDSf CDSi CDSi CDSl 3’UTR
单倍型A ：
单倍型B ： 单倍型C ： 单倍型D ：
——TGGAATCATGGA——————TGTTATGCC——
第五个外显子区域
二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析
5、候选基因的关联分析——确定目标基因的单倍型
100份自然群体中启动子区差异位点的测序分析
启动子差异位点的部分测序结果
二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析
5、候选基因的关联分析——确定目标基因的单倍型 启动子区域差异在497份自然群体中的关联分析
序列_0 序列_1
序列_0 序列_1
miR164的结合 位点？
二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析
10、候选基因的可能miRNA调控机制？
8 7 6 5 4 3 2 1 0 B73-1 X-1 B73-2 X-2 B73-3 X-3 B73-4 X-4
图 miR164在B73和突变体不同组织中的表达
粒长（cm）
粒宽（cm）
粒厚（cm）
图2 突变体和野生型籽粒性状的比较
二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析
1、表型特征观察——突变体表现为植株变矮，胚乳细胞大小无明显变化
140kb
a：大粒的电镜示意图
b: 小粒的电镜示意图
二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析
2、组织细胞学分析——突变体的叶片、茎和跟部细胞与正常自交系相同
AS2-1
GGACAGAGACAGGTTTAACAATC
基于AC—PCR的SNP标记
二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析
6、候选基因的进化分析
二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析
6、候选基因的进化分析
在水稻和大刍草中启动子区域两个差异位点的分析
不同基因型水稻自交系的扩增结果
不同基因型大刍草扩增结果
5、候选基因的关联分析——确定目标基因的单倍型
候选基因100份自然群体中外显子区差异位点的测序分析
第二个外显子区域
第五个外显子区域
二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析
5、候选基因的关联分析——确定目标基因的单倍型
100份自然群体中外显子区差异位点的测序分析
外显子差异位点一的部分测序结果
二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析
GRMZM2G138125 G-protein coupled receptor protein signaling pathway，ATP binding，integral to membrane GRMZM2G176881 structural molecule activity，tight junction GRMZM2G376731 intracellular protein transport， GRMZM2G113990 coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain-containing protein 4 GRMZM2G114153 FIP1 GRMZM2G176677 regulation of transcription GRMZM2G357972 histone-lysine N-methyltransferase activity，chromatin modification GRMZM2G428386 phosphatidylinositol phosphate kinase activity GRMZM2G438841 homoiothermy， GRMZM2G039711 hypothetical protein GRMZM2G053317 No GRMZM2G127581 hypothetical protein GRMZM2G138190 Putative uncharacterized protein
2013年11月洛阳
玉米籽粒发育关键基因的克 隆与功能解析
河南农业大学
汤
继
华
2013年6月27日
一、玉米籽粒发育关键基因克隆研究意义
提高玉米单产的三个要素： 增加亩穗数——种植密度、株型（叶夹角）、抗倒性等 增加穗粒数——穗行数（穗粗）和行粒数（穗长） 提高粒重——增加籽粒体积（库）和光合产物积累（流）
二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析
在水稻和大刍草中对启动子区域两个差异位点进行分析
二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析
7、候选基因的表达分析
候选基因主要在分裂活跃的组织和器官中表达，而且野生型中的表达 量明显高于突变体。 B A
1
0.8 0.6 1.5 0.4
2.5
2
Wild type Mutant
豫82
玉米的高密度栽培
2009年河南玉米的大面积倒伏
一、玉米籽粒发育关键基因克隆研究意义
籽粒体积大小是光合产物积累的“库”，是决定玉米籽粒重
量的关键因子。
粒长
粒宽
粒厚
籽粒体积的三个构成因子
一、玉米籽粒发育关键基因克隆研究意义
光合产物的有效 积累期，即“流”
15d
35d
45d
玉米灌浆速率的动态曲线
预测有3个候选基因。
二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析
4、候选基因的序列分析——确定目标性状的候选基因
候选基因在突变体与野生型的 启动子区域有 2 个插入，编码区不 存在差异。
该 基 因 编 码 Cyclin-related
protein，全长2578bp，包含5个外 显子，编码337个氨基酸。
野生型 突变体
1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00
1.26 1.25
Wild type Mutant
百粒重（g） 32.90 40.00 22.06
0.75 0.72 0.47 0.36
30.00 20.00 10.00 0.00 Wild type Mutant
5、候选基因的关联分析——确定目标基因的单倍型
编码区差异位点在497份自然群体中的关联分析
Primer
CACGACGTTGTAAAACGACCACCACAGAAGTCGAGATGG CACCACAGAAGTCGAGATGC
AS1-1
CACGACGTTGTAAAACGACGGACAGAGACAGGTTTAACAATT
？
序列_0 序列_1
miR164的抑制 表达的转化？
CACGTGCTG-----CCTCGCCCGTTTGATTTCTCCGTGCCCGAAGACGCGCCGTGAAACC CACGTGCTGTTATGCCTCGCCCGTTTGATTTCTCCGTGCCCGAAGACGCGCCGTGAAACC ********* **********************************************
图9 ZmCRP在突变体和野生型叶片 和根中的表达
图
ZmCRP在突变体和野生型不
同时期胚乳中的表达
二、玉米粒厚候选基因的克隆与功能分析
8、候选功能分析——ZmCRP 过表达可以导致拟南芥籽粒增大。