《现代仪器分析实验技术与方法》
二、液相仪器及其结构
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二、液相仪器及其结构
分配色谱
• 正相分配色谱：流动相极性＜固定相极性 • 反相分配色谱：流动相极性＞固定相极性 化学键合相色谱 反相：固定相：C18, C8 流动相：水，甲醇，乙腈等极性溶剂的混合溶剂 适合极性小的芳香族化合物 正相：固定相：-CN, -NH2 流动相：烷烃，异丙醇，四氢呋喃等的混合溶剂 适合于极性差异大的化合物
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二、液相仪器及其结构
2.3.3 液相色谱柱的保养
（1）柱易被极细的颗粒堵塞，因此必须将流动相仔细地蒸馏、过滤。在流 动相贮槽与柱之间，使用0.5μm孔径的过滤器。 （2）在水溶液流动相（如缓冲液）中，细菌容易生长，可能堵塞筛板。防 止细菌生长的办法是加入抑制剂，如0.01%NaNO3。显然，抑制剂不能 干扰分离和测定。 （3）在恒定压力下，发现流量减少，柱子可能部分堵塞。堵塞最容易发生 在极窄的入口接头处以及入口、出口筛板处。堵塞后需要仔细拆洗，清除 堵塞物，但必须防止较强的机械震动，防止用热手接触柱子，致使柱内的 固定相层被扰动，使柱效发生变化。 （3）柱子的实际操作压力应低于填装时的最高压力，最好在最高压力的一 半以下。实际操作压力过高，易使入口的固定相层下沉，形成一个空穴。 若空穴形成，应重新装柱。在空穴中加入新的匀浆或玻璃微珠，也无法恢 复到原来的柱效。 （4）应该用进样阀进样，而不用注射器进样，以防止注射隔膜碎屑集聚在 柱入口。
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二、液相仪器及其结构
下列优良/常规实验操作能够最大限度降低维修费用：

清洁仪器, 流动相和样品;如果必要, 进行过滤。 保证溶剂的相溶性。


仪器使用完毕，冲洗整个系统，去掉盐份，防止污染。
对仪器的维护和保养进行记录。 定期使用异丙醇冲洗系统。


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一般为填充柱，内填液相色谱固定相。不同类型的固定相可以实现 不同类型的分离方法和分离效果。具有特定手性的固定相还可以对 不同手性构象的底物进行分离。
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二、液相仪器及其结构
2.3.1 固定相材料
按材料分类 刚性固体固定相：硅胶及表面改性硅胶 硬胶固定相： 按孔隙类型分类 表面多孔型： 实心玻璃珠外覆盖一层多孔材料（ 如硅胶） 全多孔型： 由10 nm的硅胶微粒制成， 表面多孔型 全多孔型 各种树脂
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• • •
液-固吸附色谱 （Liquid-solid adsorption chromatography, LSAC）
离子交换色谱（Ion-exchange chromatography） 空间排阻色谱（Size-exclusion chromatography） 亲和色谱法（Affinity chromatography）
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三、液相色谱的定性定量方法

外标法
仪器分析常用的方法之一，是比较法的一种。与内 标相比，外标法不是把标准物质加入到被测样品中， 而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得 到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求 得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质 但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被 测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。 外标法在操作和计算上可分为校正曲线法和用校正 因子求算法。
混合器：体积不宜大，靠动力学特性而混合
脉动阻尼器：种类多，都有一定容积和弹性 压力测量装置：电子压力控制器流量 测量装置：电子流量计 脱气装置：除掉溶于流动相中的各类气体，以保证柱 效能。根据不同需要可采用通氮脱气、超声脱气、自 动脱气机脱气等。
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2.2 进样装置
内标法是将一定质量的纯物质作为内标物加到一定 量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品 进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积 （或峰高）及相对校正因子，即可求出被测组分在样 品中的百分含量。
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三、液相色谱的定性定量方法
计算方法
1：精密称（量）取对照品和内标物，分别配成溶液。精密量取各溶液 ，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量进样，记录色谱图。 用含对照品和内标物的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式算出校 正因子（f）：
f= (As/ms)/(Ar/mr)
其中As和Ar分别为内标物和对照品的峰面积或峰高，ms和mr分别 为加入内标物和对照品的量。 2：取含有内标物的待测组分溶液进样，记录色谱图，再根据含内标物 的待测组分溶液色谱峰响应值，计算含量（mi）：
mi=f×Ai/(As/ms)
其中 Ai和As分别为待测组分和内标物的峰面积或峰高，ms为加入 内标物的量。
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2.5 液相色谱检测器
• 紫外吸收检测器（Ultraviolet Visible Detector，UVD） 目前在HPLC中应用最广泛的检测器。包括： 可变波长紫外检测器（VWD） 二极管阵列检测器（DAD）
• 荧光检测器（Fluorescence Detector，FD）

2.4.2 溶剂过滤
不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器，降低泵 的操作性能。

遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器的寿命： 使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌。 用滤膜过滤溶剂去除微生物。 每两天更换或过滤溶剂。




避免溶剂瓶直接日照。
向溶剂中加入0.0001-0.001M的叠氮化钠。
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Agilent HP 100
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2.1 高压输液系统
2.1.1 高压泵
(1) 往复恒流泵
15 ～ 35 MPa 脉冲小 流量稳定可调 耐腐蚀性
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二、液相仪器及其结构
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2.3.2 主要分离柱类型
• 分配色谱：
液液分配色谱（Liquid-liquid partition chromatography）
化学键合相色谱（Chemically bounded phase chromatography, CBPC） 反相离子对色谱
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置。另外 可以安装自动进样器实现自动化大批量样品处理。
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2.3 分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减小 填料粒度和柱径以提高柱效。按照柱子的用途可以分为用来进行大量样 品分离的制备柱和用来进行痕量样品分析的检测柱
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一、液相色谱原理介绍

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常 压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方 法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法 (High performance Liquid Chromatography，HPLC)是 在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相 色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区 别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起 高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法 (High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因 分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。
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2.4 液相色谱的流动相
流动相的物理、化学性质及其纯度将直接影响到色 谱系统的：
• 固定相的稳定性 • 分离效率 • 分离速度 • 检测灵敏度
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2.4.1 流动相的选择原则：
为了保持色谱柱的稳定性，要求： 1) 与固定相不互溶 2) 不发生不可逆吸附 3) 有合适的pH值（需注意与另一溶剂混合后不析出固体） 化学惰性——不与样品及固定相发生反应。 适用于所选择的检测器 对样品有很强的溶解力。 清洗与更换方便：可减少更换溶剂时的间隔时间。 低价、毒性小、纯度高。 低粘度。

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二、液相仪器及其结构
a) 排除物理性质不合适的溶 剂(沸点、粘度、紫外吸收 等); b) 选择洗脱强度适当的溶剂 (k’在1~10或0.5~20之 间);
c) 选择分离因子合适的溶剂 （α>1.05)。
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二、液相仪器及其结构
外标法
要求仪器重复性很严格，适于大量的分析样品，因为 仪器随着使用会有所变化，因此需要定期进行曲线校 正。在液相色谱中用的最多。
内标法
要求对于内标物的选择要严格，操作较复杂，适于分 析样品量较少的情况。在标准方法中用的最多
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三、液相色谱的定性定量方法

内标法
Байду номын сангаас
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三、液相色谱的定性定量方法

校正曲线法（标准曲线法）：
用已知不同含量的标样系列在相同的液相条件下进行 进样分析，然后做出响应信号与含量之间的关系曲线， 也就是校正曲线（标准曲线）。定量分析样品时，在测 校正曲线相同条件下注入待测样品，从色谱图上测出峰 高或峰面积，再从校正曲线查出样品的含量。
利用两台（二元 泵）或四台（四 元泵）高压输液 泵，将两种或四 种不同极性的溶 剂按一定的比例 送入梯度混合室， 混合后进入色谱 柱。溶剂比例可 依照需要进行改 变和控制。