(教学课件)免疫分析
1990年德国推出的全自动管式ELISA分析系统和配 套试剂
用链霉亲和素包被的聚苯乙烯管、生物素结合的抗 原或抗体,辣根过氧化物酶标记的抗体和显色底物 ABTS
测定中标准曲线可使用2星期,每次测定只需一点 定标
测定的精密度CV在3%左右
5、微粒固相酶免疫测定仪
美国生产自动酶免疫分析仪应用聚苯乙烯微粒(颗 粒直径0.47μm)作为固相,特异抗体或抗原包被在 微粒上。
1、微孔板固相酶免疫测定仪器
有单通道和多通道两种类型 工作原理与主要结构和光电比色计相同 不同之处在于:
比色液的容器是塑料微孔板 以垂直光束通过待测液 通常使用光密度OD来表示吸光度
2、半自动微孔板式ELISA分析仪
在酶标仪的基础上再配置:
加液器 温育器 洗板机 测读仪
测定中需由手工将微孔板移至下一步骤的仪器中进行。
特异抗体或抗原包被的磁微粒(颗粒直径1μm)
FITC结合的特异抗体或抗原
碱性磷酸酶标记的特异抗体或抗原
什么样的反应
底物酚肽(phenolphthalein)磷酸酯
反应结束后将试管架放在磁铁板上,磁微粒被磁铁 吸引至管底,完成固相与液相的分离。酶作用后反 应液呈粉红色。
磁颗粒ELISA是将两株单抗分别标记酶和异硫氰 酸荧光素(FITC),另将一抗FITC抗体经化学反应 与磁颗粒偶联,制成可磁化固相通用分离剂。测 定时将样品和两种标记单抗加至试管中温育,然 后加入可磁化抗FITC颗粒分离剂,生成夹心免疫 复合物,洗涤,加酶底物显色。
标记抗体 (二抗)
待测抗 体
间接法原理
包被体
包被抗 原
标记抗原
俘获法原理
包被体
待测抗体
俘获抗体 (二抗)
标记抗原 待测抗体
双抗原夹心法原理
包被体
包被抗原
我们把采用酶标的方法测定物质含量的设备称为 酶标仪。
一般简单的酶标仪只有读数、数据处理的功能, 还需要配置孵育箱,洗板机,人工操作步骤繁琐 。
三、酶免疫分析仪的性能评价和维护保养
(一)评价指标和方法
1.滤光片波长精度检查及其峰值测定 2.灵敏度和准确度 3.通道差与孔间差检测 4.零点飘移 5.精密度评价 6.线性测定 7.双波长评价
重点是光学部分 1.滤光片波长精度检查 2.通道差与孔间差检测
四、酶免疫分析仪的临床应用
1.病原体及其抗体的检测 2.各种免疫球蛋白和细胞因子、补体等 3.肿瘤标志物 4.多种激素 5.药物和毒品
ELISA)
需要了解的基本概念
▪ 酶免疫测定(Enzyme Immunoassay, EIA)
✓ 均相酶免测定 对象为小分子抗原或半抗原,主要用于药物 测定
✓ 异相酶免测定 需经过结合的标记物和游离的标记物的分离 才能测定. 分离的方法主要通过固相载体,故此法称为固相 酶免疫测定ELISA 。
▪ ELISA的测定模式 :
第十一章 免疫分析技术和相关仪器
第一节 酶免疫分析仪
一、酶免疫分析技术的分类:
酶免疫分析(enzyme immunoassay,EIA)
根据是否需要分离结合与游离的酶标记物,可分为: 酶扩大免疫测定
均相酶免疫测定
非均相酶免疫测定
克隆酶供体免疫测定 液相酶免疫法
固相酶免疫法
(酶联免疫吸附测定 enzyme linked immunosorbent assay,
✓ 双抗体夹心法 ✓ 间接法 ✓ 竞争法
双抗体夹心法(三明治法)原理
待测物
标记抗体
固相支持物表面
包被抗体
夹心法的剂量--反应关系曲线
信号强度(Y)
Hook效应
线性范围
待测物浓度(X)
竞争法的原理
待测物 标记抗原
固相支持物表面
包被抗体
竞争法的剂量--反应关系曲线
信号强度( Y )
线性范围
待测物浓度( X )
第一次抗原抗体反应后,将反应液通过特制的玻璃 纤维膜,聚苯乙烯微粒吸附在玻璃纤维膜上,液体 则通过膜滤出。
以后的反应在膜上进行,标记酶为ALP,底物为4甲基伞酮磷酸酶,反应后进行荧光测定。
6、磁微粒固相酶免疫测定仪
瑞士出品的分析系统由分光光度测读仪、磁铁板和 试剂组成:
试剂包括:
抗异硫氰酸荧光素(FITC)抗体
辣根过氧化物酶的色原底物
HRP最常用的色原底物有:
邻苯二胺(OPD)、2,2’-吖嗪-(3-乙酰苯基噻唑磺酸6)[ABTS](杂环吖嗪)
四甲基联苯胺(TMB) 4-氨基安替比林:苯酚耦联底物对
OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一,其在HRP的 作用下,由过氧化氢(H202) 氧化而聚合成2,2’-二氨基偶 氮苯(DAB)。在pH5.0左右时,DAB在波长450nm处有广范 围的最大吸收,当pH值降为1.0时,最大吸收波长移动至 492nm,同时摩尔消光系数变大,显色加深。因而常用强 酸如硫酸或盐酸终止反应。OPD的缺点是其对机体具有致 突变作用。
稳 定:
只要避免人为操作错误, 可连续数年良好工作。
准 确:
不存在交叉感染。反应振荡, 确保检测 准确。
高 速:
加注、读板速度快
扩 展 性:
软件可升级,样本量增加,可联机使用
用户做主更多:
开放式试剂 WINDOW操作系统 中/英/日自选操作界面 自定义编程 自动/自定义时间表 无限存档
4、管式固相酶免疫测定仪
检测时间:以乙肝两对半(立可读)为例
仪器操作各单元如下(满板)
加样品时间:6-7分钟;9-10分钟(使用液面传感器) 加酶时间: 4分46秒(洗5遍,不浸泡) 加两种显色剂A、B共: 5分30秒 加终止液: 2分42秒 读板时间: 2分58秒
优势
自动化程度高:
前后处理一体化设计,减少人与样品的 接触机会,降低感染。各种自动安全检 测能。
3、全自动微孔板式ELISA分析仪
自动化酶免疫分析系统由:
加样系统 温育系统 洗板系统 判读系统 机械臂系统 液路动力系统 软件控制系统等组成
温育箱 反应板 迭式存储器
X-Y头架
样品架
50根 装
50×3
4根独立 上下吸 移管
检 测 光 纤
反应板
反应板 夹具
清 洗 装 置
供水箱 废水箱
全自动酶联免疫系统集加样品、加试剂、孵育 、震荡、洗板、读数、数据处理7大功能于一体。
二、酶免疫分析仪的类型、工作原理及 基本结构
微孔板固相酶免疫测定仪器(酶标仪) 半自动微孔板ELISA分析仪 全自动微孔板ELISA分析仪 管式固相酶免疫测定仪器 小珠固相酶免疫测定仪器 磁微粒固相酶免疫测定仪器等