设计一个片段分解的策略 选择合适的载体 载体双酶切 片段PCR克隆,双酶切
设计一个功能验证的策略 选择内切酶种类和设计引物 酶连转化
大肠杆菌 DH5а
三亲杂交到KT 功能验证
双酶切
双酶切
酶连
内切酶的选择
只有Apa I和EcoR I可供选择
正向引物 5’---CGCTGAATTCGTGAAGTTGCCATATCGCTTAG---3’ EcoR I 保护碱基
三、基因工程所用到的克隆载体
以扩增外源DNA为目的载体-克隆载体（cloning vector）
（1）载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制
（2）载体应具有酶切位点，便于外源DNA的插入 （3）载体必须具有可供选择的遗传标记
还应具备的特点：
a）低分子量；
b）具有较高拷贝数；
c）易于导入细胞； d）具有安全性；
反向引物 5’---TATAGGGCCCTTGGCTTGATCGCTAAA---3’ Apa I 保护碱基
N=ln（1-p）中每个独立克隆所含有外源DNA片段的平均 clones and puc19
阳性克隆在含有相应农药的平板上产生水解圈
如何做亚克隆?-----以四氢嘧啶降解相关基因为例
穿梭载体
表达载体
基因工程的基本过程
1. 基因分离或合成： 2. 体外重组
3. 重组载体导入受体细胞
4.特定克隆子的筛选菌株或突变菌株
筛选能功能互
Total DNA extraction
EcoRI E： 表示大肠杆菌属名第一个字母 co： 表示种名头两个字母 R： 表示株名 I： 表示该菌中第一个被分离出来的酶。
5`-A A G C T T-3` Hind III的识别序列： 3`-T T C G A A-5`
5`-A 3`-T T C G A
A G C T T-3` A-5`
切割后形成具有粘性末端（cohesive end）的DNA片段： 限制性酶一般不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切 割结果形成5 或3单链突出的粘性末端的DNA限制片段。 二个具有互相匹配的粘性末端的DNA片段可以通过碱基 的互补及DNA连接酶的作用而重新连接起来。
HpaI的识别序列：
5` - G T T A A C - 3` 3` - C A A T T G - 5`
5` - G T T 3` - C A A
A A C - 3` T T G - 5`
切割后形成具有平末端（blunt end）的DNA片段：
限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段 没有突出的单链。
Sau3AI partial digest(gatc)
puc19载体提取
puc19载体 BamH I 酶切
Sau3AI:
Recovery of 2-4kb fragments 载体脱磷
gatc ctag g gatc c c ctag g
BamH I:
ligation
转化,挑选转化子
筛选阳性克隆在理论上，构建的基因采用 Clarke的统计公式计算：
基因克隆的技术方法探讨
2008.11.28
基因工程所用到的酶系
（一）限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割 DNA的一类内切酶。简称为限制性酶（restrition enzyme）。
取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成 三个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同 一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。
具有平末端的DNA片段也可以在DNA连接酶的 作用连接起来
（二）DNA聚合酶 具有催化DNA链从5’→3’方向聚合反应的活性，还具 有从5’→3’(其小片段)和从3’→5’(大片段)的外切核酸 酶活性。
（三）DNA连接酶（DNA ligase） DNA连接酶可以将两个DNA片段的3’-OH与5’-P连接起 来