附件食品微生物之檢驗方法－阪崎腸桿菌之檢驗1 適用範圍〆本方法適用於一般食品及奶粉中阪崎腸桿菌之檢驗。

2 檢驗方法〆2.1 工作環境〆工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。

每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。

2.2 器具及材料〆2.2.1 乾熱滅菌器。

2.2.2 高壓滅菌釜。

2.2.3 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）〆適用於無菌操作者。

2.2.4 天平〆可稱量到2000 g者，靈敏度為0.1 g々可稱量到120 g者，靈敏度為1 mg。

2.2.5 冰箱〆能維持5 ±3℃者。

2.2.6 吸管或吸管尖〆已滅菌，1 mL吸管應有0.01 mL之刻度々5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL之刻度。

2.2.7 吸管輔助器（Pipette aid）或微量分注器。

2.2.8 稀釋瓶〆160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、鐵弗龍（Teflon）或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質，附螺旋蓋。

2.2.9 培養皿〆已滅菌，內徑約9 cm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮傷或其他缺點。

2.2.10 增菌用容器〆附螺旋蓋之125 mL、250 mL、2 L三角錐瓶或廣口瓶々玻璃、聚乙烯、鐵弗龍或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質。

2.2.11 pH測定儀。

2.2.12 培養箱〆能維持內部溫度在±1℃以內者。

2.2.13 溫度計〆量測溫度範圍1～55℃，最小刻度0.1℃。

2.2.14 水浴〆加蓋，具水流循環系統，能維持水溫溫差在±0.2℃以內者。

2.2.15 接種針及接種環（直徑約3 mm）〆鎳鉻合金、鉑銥或鉻線材質，或可拋棄式者。

2.2.16 曲玻棒〆可滅菌者，直徑3～4 mm，塗抹區域45～55 mm。

2.2.17 試管〆10 ×100 mm，13 ×100 mm，13 ×120 mm，15 ×150 mm，16 ×150 mm試管，或其他適用者。

2.2.18 旋渦混合器（Vortex mixer）。

2.2.19 顯微鏡〆能放大至1000倍以上之一般光學顯微鏡。

2.2.20 載玻片及蓋玻片〆適用於染色及鏡檢用。

2.2.21 研缽、杵。

2.2.22 藥勺、剪刀、小刀、鑷子〆可滅菌。

2.2.23 濾紙及褐色試藥瓶。

2.2.24 無菌濾膜〆孔徑0.45 μm或以下之親水性醋酸纖維膜。

2.2.25 杜蘭發酵管（Durham fermentation tube）〆外徑9 ×22 mm或其他適用者。

2.2.26 試藥〆氯化鈉、硫酸月桂酸鈉（sodium lauryl sulfate）、膽鹽No. 3（bile salts No. 3）、中性紅（neutral red）、結晶紫（crystal violet）、檸檬酸鐵銨（ferric ammonium citrate）、去氧膽酸鈉（sodium desoxycholate）、硫代硫酸鈉（sodium thiosulfate）、草酸銨（ammonium oxalate）、碘化鉀、碘、沙黃O（safranin O）、對-二甲胺基苯甲醛（p-dimethyl aminobenzaldehyde）、四甲基對位苯二胺鹽酸鹽（N,N,N',N'-tetramethyl -ρ-phenylenediamine〄2HCl）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4〄H2O）、硝基苯哌喃半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-哌喃葡萄糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside）、亮綠（brilliant green）、酚紅（phenol red）、溴甲酚紫（bromcresol purple）、溴麝香草藍（bromthymol blue）、肌酸（creatine）、甲基紅（methyl red）、α-萘酚（α-naphthol）、氫氧化鉀、95%乙醇、無水乙醇、戊醇（amyl alcohol）或異戊醇（isoamyl alcohol）、乳糖、蔗糖、半乳糖醇（dulcitol）、核糖醇（adonitol）、棉子糖（raffinose）、山梨醇（sorbitol）、阿拉伯糖醇（D-arabitol）、氰化鉀、氫氧化鈉、L-離胺酸（L-lysine）、L-鳥胺酸（L-ornithine）、L-精胺酸（L-arginine）、礦物油或液態石蠟油（paraffin oil）及鹽酸等均採用化學試藥級。

2.2.27 試劑〆2.2.27.1 無菌蒸餾水〆蒸餾水900 mL、90 mL、9 mL，分裝於增菌容器或試管中，以121℃滅菌15分鐘。

2.2.27.2 0.85%生理食鹽水〆取氯化鈉8.5 g溶於1000 mL蒸餾水中，分裝於試管內，以121℃滅菌15分鐘。

2.2.27.3 柯瓦克氏試劑（Kovacs’ reagent）〆取對-二甲胺基苯甲醛5 g溶於戊醇或異戊醇75 mL中，再徐徐加入鹽酸25 mL，混合均勻後應呈黃色並須保存於4℃冰箱中。

2.2.27.4 甲基紅指示劑（Methyl red indicator）〆取甲基紅0.1 g溶於95%乙醇300 mL後，再加蒸餾水使成500 mL。

2.2.27.5 歐普氏試劑（Voges-Proskauer test reagents, VP reagents）〆溶液A〆取α-萘酚5 g溶於無水乙醇100 mL中。

溶液B〆取氫氧化鉀40 g溶於蒸餾水中，並使成100 mL。

2.2.27.6 0.5%氰化鉀溶液（0.5% potassium cyanide solution）〆取氰化鉀0.5 g溶於無菌蒸餾水100 mL中（氰化鉀為劇毒物質，本操作務必在抽氣櫃內進行）。

2.2.27.7 礦物油或液態石蠟油〆取礦物油或液態石蠟油20～50 mL，裝入有蓋容器中約1/2滿，以121℃滅菌30分鐘。

2.2.27.8 革蘭氏染色液（Gram stain solution）〆2.2.27.8.1 哈克氏（Hucker’s）結晶紫液（初染劑）〆溶液A〆取結晶紫2 g溶於95%乙醇20 mL中。

溶液B〆取草酸銨0.8 g溶於蒸餾水80 mL中。

將溶液A與溶液B混合，靜置24小時後以濾紙過濾，取濾液作為初染劑。

2.2.27.8.2 革蘭氏碘液（媒染劑）〆取碘化鉀2 g及碘1 g置於研砵中，經研磨5～10秒鐘後，加蒸餾水1 mL研磨，次加蒸餾水5 mL研磨，再加蒸餾水10 mL，研磨至碘化鉀和碘完全溶於水中，將此溶液注入褐色瓶中，再以適量蒸餾水洗滌研砵及杵後，併入洗液，加蒸餾水使成300 mL。

2.2.27.8.3 哈克氏複染液（複染劑）〆取沙黃O 2.5 g溶於95%乙醇100 mL中，供作複染原液。

使用時，取原液10 mL加蒸餾水90 mL，作為複染液。

註〆革蘭氏染色液因放久可能失效，因此若購買成品時，要注意其保存期限，若自行配製者應檢查其染色效果。

2.2.27.9 氧化酶試劑（Oxidase reagent）〆取四甲基對位苯二胺鹽酸鹽1 g溶於蒸餾水100 mL後，貯存於褐色瓶，並置入冰箱中，使用期限以不超過1星期為宜。

2.2.27.10 1 M磷酸二氫鈉溶液〆取磷酸二氫鈉6.9 g溶於蒸餾水45 mL中，徐徐注入30%氫氧化鈉溶液約3 mL，調整pH值為7.0，續加入蒸餾水使成50 mL，貯存於4℃冰箱中備用。

2.2.27.11 硝基苯哌喃半乳糖試劑（ONPG reagent）〆取硝基苯哌喃半乳糖80 mg溶於37℃蒸餾水15 mL中，再加入1 M磷酸二氫鈉溶液5 mL，即為0.0133 M硝基苯哌喃半乳糖試劑，貯存於4℃冰箱中，使用時須加溫至37℃。

2.2.28 培養基〆2.2.28.1 蛋白腖緩衝液（Buffered peptone water, BPW）蛋白腖（peptone）10 g氯化鈉（NaCl） 5 g磷酸氫二鈉（Na2HPO4）3.5 g磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.5 g蒸餾水1000 mL攪拌加熱溶解後，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.2 ±0.2。

2.2.28.2 加鹽硫酸月桂酸胰化蛋白培養液（Lauryl tryptose broth with 2% NaCl, 2% NaCl-LST）胰化蛋白（tryptose）20 g乳糖（lactose） 5 g磷酸二氫鉀（KH2PO4）2.75 g磷酸氫二鉀（K2HPO4）2.75 g氯化鈉（NaCl）20 g硫酸月桂酸鈉（sodium lauryl sulfate）0.1 g蒸餾水1000 mL加熱溶解後，分取10 mL注入裝有杜蘭發酵管之試管內，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.8 ±0.2。

2.2.28.3 紫紅膽鹽葡萄糖培養基（Violet red bile glucose agar, VRBG）酵母抽出液（yeast extract） 3 g蛋白腖（peptone）7 g氯化鈉（NaCl） 5 g膽鹽No. 3（bile salts No. 3） 1.5 g乳糖（lactose）10 g中性紅（neutral red）0.03 g結晶紫（crystal violet）0.002 g洋菜（agar）15 g葡萄糖（glucose） 10 g蒸餾水1000 mL加熱至沸騰溶解，注意不可加熱過度。

於45～50℃水浴中冷卻，最終pH值為7.4 ±0.2。

每培養皿注入約20 mL，凝固後確定表面乾燥後使用。

配製後之培養基應放置於2～8℃冰箱中保存，但須於一個月內使用完畢。

2.2.28.4 阪崎腸桿菌培養基（Enterobacter sakazakii agar, ESA）胰化蛋白腖（tryptone）15 g大豆蛋白腖（soya peptone） 5.0 g氯化鈉（NaCl） 5.0 g檸檬酸鐵銨（ferric ammonium citrate） 1.0 g去氧膽酸鈉（sodium desoxycholate） 1.0 g硫代硫酸鈉（Na2S2O3〃5H2O） 1.0 g5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-哌喃葡萄糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside）0.1 g洋菜（agar）15 g蒸餾水1000 mL攪拌加熱溶解後，以121℃，滅菌15分鐘，最終pH值為7.3 ±0.2。