sgLkb1
Kras同源 修补
P53的基因变化
• 多为移码突变
Lkb1的基因变化
• 多为移码突变
Kras的基因变化
P53和Lkb1不断被损坏， Kras则被修补变得越发优势
最终肺中出现肿瘤
总结
• 事实证明将Cre-dependent引入Cas9工具中， 可以大大扩展Cas9的用途。
• 以后用此方法可以更好的对基因进行修整， 已达成更多的实验，为人类医学和生物学作 出贡献。
一、慢病毒转入树突状细胞
——转入树突状细胞实验过程
通过荧光蛋白EGFP可以鉴别 Cas9是否转导成功
设计了两个剪切位点

有转入目的基因 的小鼠大多细胞目的 基因发生移码突变， 目的基因转录和翻译 都明显下调。
二、腺病毒转入大脑皮层额叶
目标基因是NeuN
目的基因发生的改变
✓ 缺失一位 ✓ 缺失多位 ✓ 插入一位 ✓ 插入多位
CRISPR-Cas9系统的原理
sgRNA
通过设计sgRNA来确定剪切位点 设计简单快速，无需重复构建核酸内切酶
target
Cas9的局限性
• 受限于转基因范围，Cas9往往只用与细胞或胚 胎层面的实验。
• 本实验采用Cre-dependent Rosa26 Cas9 knockin mouse克服了这个局限性。
CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling
CRISPR-Cas9系统的原理
crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基 配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ） 结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引 导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶 位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA， 可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点 切割。
Thanks！
荧光显示含有Cre/Cas9 的组织中NeuN表达明显减
少，而非转入非目标的 sgRNA则目标蛋白无影响
NeuN被破坏的比例十分大
Indel=insertions(插入) and deletions(删除)
多数为两个等位基因都被破坏，且其 中多为移码突变。
三、腺病毒转入肺
sgKras
sgp53
• 使得CRISPR-Cas9应用更广泛。
Cre-dependent Cas9 Rosa26 targeting 矢量图
Rosa26，使转 录可被诱导
荧光蛋白
转入Cas9后与野生小鼠对比
神经系统荧光对比
三种实验测试效果：
三种转接方法： 纳米粒子、腺病毒转导、 慢病毒转导。 三个系统（器官）： 免疫、神经、肺（癌）。