the formation of flavour components in cider[J].J I Brewing,1988,94(6):391-395.[26]MANGAS J J,GONZALEZ M P,RODRIGUZE R,et al.Solid-phaseextraction and determination of trace aroma and flavour components in cider by GC-MS[J].Chromatographia,1996,42:101-105.[27]WILLIAMS A A,MAY H V.Examination of an extract of cidervolatiles using both electron impact and chemical ionization gas chro-matography-mass spectrometry[J].J I Brewing,1981,87:372-375. [28]POLLARD A,KIESER M E,STEVENS P M,et al.Fusel oils in cidersand perries[J].J Sci Food Agr,1965,16:384-389.[29]龙明华.以浓缩苹果汁酿造的苹果酒挥发性香气成分分析[J].酿酒科技，2006（6）：94-95.[30]彭帮柱，岳田利，袁亚宏，等.气相色谱-质谱联用法分析苹果酒香气成分的研究[J].西北农林科技大学学报，2006，31（1）：71-74.[31]岳田利，彭帮柱，袁亚宏.基于主成分分析法的苹果酒香气质量评价模型的构建[J].农业工程学报，2007，23（6）：223-227.[32]林巧，杨永美，孙小波，等.苹果酒发酵条件的控制与研究[J].中国酿造，2008（10）：60-63.手性是自然界化合物的普遍特征。

构成自然界物质的一些手性分子虽然从化学式组成来看是一模一样，但其空间结构完全不同，其性质也是不同的[1]。

如DL-（±）-合霉素的治疗效果仅为D-（-）-氯霉素的一半；20世纪50年代欧洲发生的“海豹儿”出生的灾难性事故，正是由于“反应停”是一种外消旋的手性药物，其（R）型异构体具有镇静作用，而（S）型却具有致畸作用。

因此，如何将物质纯化为光学纯级别是目前化学工业的重要研究目标。

α-苯乙胺（DL-α-Phenylethylamine）是一种有着良好应用前景的化工中间体原料，由于α-苯乙胺分子中含有一个手性中心，可分为（R）和（S）2种对映异构体及外消旋α-苯乙胺，其中（R）、（S）这2种单一对映体既可以作为某些外消旋有机酸或醇类物质的手性拆分试剂，又可以作为不对称合成的手性原料，因此是一种重要的手性中间体[2]。

目前光学纯级别化合物的获得方法主要有手性合成和外消旋体拆分2种。

本文主要阐述利用脂肪酶对外消旋α-苯乙胺的拆分研究进展。

1脂肪酶拆分机理分子模拟研究表明，对映体在Candida Antarctica脂肪酶B活性中心以不同的方式定向[3]。

手性底物的对映体以不同方式定向和结合到酶活性中心，这一事实可以作为改变对映体选择性的依据。

目前被普遍接受的是“立体特异性口袋”理论：在酶的立体结构中存在着一个氧负离子空洞，称为“活性口袋”，这个活性口袋是由几个氢键供体构成的，主要为酶骨架及其侧链中酰胺的质子。

而决定脂肪酶底物选择性的最重要因素正是活性口袋的空间限制和疏水性质以及四面体中间体的稳定性。

JENSEN R G等[4]通过研究Candida Antarctica脂肪酶B与2-己酸辛酯的过度态结构对该脂肪酶的立体选择性进行了分析，从结构来看，酶活性部位是由一个丝氨酸、一个组氨酸和一个天冬氨酸的残基（Ser-His-Asp）组成的“催化三联体”，并且活性部位呈“手性”构象，具有高度选择的特征。

脂肪酶在催化过程中将这种特征传递给手性底物，使反应具有内在的选择性，即优先催化底物中的某些组分，客观上表现为不同竞争性底物反应速度的差异[5]。

2脂肪酶的选择酶法拆分手性物质主要是利用酶的立体选择性，整个反应过程就是外消旋底物的2个对映体竞争酶的活性脂肪酶拆分外消旋α-苯乙胺的研究进展吴华昌，由耀辉，邓静，马钦远（四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000）摘要：利用脂肪酶拆分外消旋α-苯乙胺是目前生产光学纯α-苯乙胺的重要方法之一，文中主要从脂肪酶拆分机理、脂肪酶的选择、酰化剂的选择及反应体系溶剂的确定等方面，阐述近年来国内外研究状况。

关键词：脂肪酶；光学纯；酰化剂；溶剂中图分类号：Q556文献标识码：A文章编号：0254-5071（2010）05-0023-03Chiral resolution of racemicα-phenylethylamine by lipaseWU Huachang,YOU Yaohui,DENG Jing,MA Qinyuan(Department of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong643000,China)Abstract:Chiral resolution by lipase is an important way for production of optically pureα-Phenylethylamine.Mechanism of chiral resolution by lipase,choice of lipases and acylation agents,and selection of reaction solvent was reviewed in the paper.Key words:lipase;optical purity;acylation agent;solvent收稿日期：2009-12-11作者简介：吴华昌（1970-），男，四川隆昌人，副教授，主要从事非水相酶催化应用研究工作。

ααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααα中心，由于两者反应速率不同而产生选择性，从而使反应产物或剩余底物具有单一光学活性。

酶的光学选择性就是通常所说的对映体选择率（enantioselectivity，E）。

E值反映的是酶拆分选择性的大小。

拆分反应的效果通常用光学纯度（optical purity，op）或对映体过量值（enantiomeric excess，e.e）来表示。

微生物脂肪酶多数来源于真菌和细菌，现在约有30多种不同来源的商业化脂肪酶，加之科研机构不断发现的新型脂肪酶，对选择一种高效立体选择性的脂肪酶给予较大的空间[6]。

脂肪酶选择性酰化α-苯乙胺的反应机理：WEN S等[7]考察了lipase LIP2（YILip2）在45℃时，以乙酸乙酯作为酰化剂，添加3%正己烷及6倍固定化脂肪酶，反应6d，产物e.e值可达到96.0%。

秦韶巍[8]考察了实验室自制的Lipase CAN、Lipase RH 2种脂肪酶对α-苯乙胺的拆分效果，并与Novozyme435、Li-pase TL、Lipase Rm、Lipase Jan等几种商品酶在35℃，以乙酸乙酯作为酰化剂和溶剂，反应48h进行了对照，结果表明，Novozyme435拆分效果最好，底物转化率达到44.6%，产物的e.e值为58.2%，由于在尚未对反应条件优化的前提下，可以认为Novozyme435是一种较为理想的商品酶。

脂肪酶选择性酰化α-苯乙胺的反应机理：VARMA R等[9]考察Lipases-L-1（Candida cylindracea-CCL）、L-4（P.seudomonas cepacia）、L-17（CAL B），L-20（Alcaligenes）、L-21（Pseudomonas fluroscens）、lipases-Chi-razymes L2（CAL B）等几种商品酶在28℃时，以乙酸乙酯作为酰化剂和溶剂时拆分α-苯乙胺效果进行比较，结果见附表。

由附表可知，L2、CAL B、PS-C、P.cepacia及PS-D、P.cepacia均有较好的拆分效果，且L2、CAL B反应时间24h，产物op值达到99.0%。

3酰化剂的选择酰化剂作为反应过程的一种底物，对脂肪酶拆分催化α-苯乙胺反应有着至关重要的作用，在选择酰化剂的同时，要考虑对酶活、反应的转化率、酶的立体选择性等的影响。

酰基链的大小、定位在与酶结合过程中是最重要的过程。

通常情况下，脂肪酶活性部位被一个“盖子”包住，在酶界面激活过程中，随着活性部位“盖子”的移动，活性部位就暴露出来，在“盖子”和酶的表面间形成一个疏水沟，沟的大小恰好容纳酰基链，沟的非极性残基和非极性酰基链间的相互作用而稳定的结合[10]。

在不可逆反应中，肟酯可以作为酰基转移试剂，但存在一些缺点：辅底物抑制和反应的可逆性。

烯醇酯作为酰基供体，是不可逆转酯化反应的最佳选择。

乙酸乙酯、甲氧基乙酸乙酯、乙氧基乙酸乙酯均是目前研究较多的酰化剂。

德国BASF公司是世界上最大的手性胺生产公司，采用甲氧基乙酸乙酯作为酰化剂拆分α-苯乙胺，现以1000t/年的规模工业化生产。

VARMA R等[9]将酰化剂由乙酸乙酯变为乙氧基乙酸乙酯，在其他条件不变的前提下（参照附表），脂肪酶PS-C 的拆分效果，从83.58%提高至99.9%；脂肪酶PS-D的拆分效果从50.20%提高至99.9%。

不同基团的酰化剂为何能提高反应效率，目前机理尚未明确。

可能由于甲氧基及乙氧基均为供给电子基团，在催化过程中竞争酶的活性中心较为有利，同时，不同脂肪酶可能对酰化剂的链长较为敏感[11]。

如Geotrichum candidum的2种异构酶的选择性差异很大。

异构酶B对长碳链不饱和脂肪酸，尤其是对9-位为顺式结构的十八碳不饱和酸具有选择性，而异构酶A的选择性则比较广泛，对中碳链和不饱和的长碳链都有作用[12]。

4反应体系溶剂的选择以前的观点认为，酶只有在水中才有活性，在有机溶剂中会立即失活，直至20世纪70年代末期才证实酶在有机溶剂中确实有活性，俄罗斯莫斯科Lomonosov大学的Klibanov 等报道了N-乙酰基-L-色氨酸在氯仿中与乙醇的酯化反应，酯的合成收率达到100%，而在无有机相的水中酯的收率仅为0.01%[13]。

LANNE C等[14]提出了利用溶剂的logP值预测酶活性的简单规则，一般酶在logP>4时反应活性较高，在2<logP<4时反应活性中等，logP<2时反应活性较低。