GST/HIS融合蛋白与细胞内源性蛋白质的 相互作用
• 细胞提取物中的内源性蛋白（提取细胞总 蛋白与GST/HIS-X融合蛋白孵育） • S32标记
GST融合蛋白与细胞内瞬时表达的蛋白质 的相互作用
• 构建 Y 的真核表达载体，转染细胞，瞬时 表达（过表达）。
待测蛋白的磷酸化状态可能产生影响
• GST/HIS-X 融合蛋白与待测蛋白的相互作 用有可能与待测蛋白的磷酸化状态有关。
蛋白质相互作用 研究方法简介
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基因组序列测定→后基因组研究时代 编码功能蛋白的基因不到三万条 已知蛋白的功能，新基因的功能探索 蛋白质功能研究或蛋白质组学研究 蛋白质相互作用研究方法作为技术平台 蛋白在发挥作用时都不是孤立的， 而是相互联系的
• 一种蛋白的功能必须借助于其它蛋白的调 节或介导。这种调节或介导作用的实现首 先要求蛋白质之间有结合作用或相互作用。 如果找到与已知蛋白有相互作用的其它蛋 白（不管这种蛋白是已知的还是未知的）， 那么这种已知蛋白的功能研究有可能进入 一个新的天地。对于新基因 情况也 是如此。
Fig.21 Cellular localization of HPO and JAB1. COS 7 cells were tranfected with GFP-HPO or RFP-JAB1 constructs, respectively. The nuclei were stained by Hoechst 33342 (blue). All cell samples were visualized by confocal microscopy (Leica).
UASs, upstream activating sequences AD, activating domain BD, binding domain
• AD/library: A fusion of the GAL4 AD with a library cDNA/protein. • DNA-BD/bait: A fusion of the GAL4 DNABD with a bait cDNA/protein.
• 蛋白质定位及共定位研究必不可少。 • 因为相互作用的蛋白在功能上相互关联。 通过蛋白共定位研究，能够确定两种蛋白 在细胞内生理条件下相互作用的区域。
有色荧光蛋白标记技术
• • • • • 也可称为活细胞定位 分别克隆X，Y至荧光蛋白载体中 共转染 表达GFP/RFP，绿/红色荧光蛋白融合蛋白 confocal microscopy 共聚焦显微镜法 • 也可同时进行核染色
• • • • 高效瞬时过表达系统 大量表达，增加复合物的量 标签 抗体
Figure 3. The Cys→Ser mutation of HPO destroying its enzyme activity disturbed neither HPO dimerization nor HPO-JAB1 interaction in vivo. COS 7 cells were cotransfected with JAB1 and either Myc-tagged HPOs (wild type or mutants) or Myc control vector. The cells lysates were incubated with a rabbit anti-JAB1 antibody then with protein A/G–Agarose. The immuno-complex was resolved on 15% SDS-PAGE and analyzed by immunoblotting with anti-Myc antibody. As an indication of the relative expression level for MycHPO, some of the total cell lysate used in immuno-precipitation was loaded onto lanes 8 (pCMV-Myc-HPOwt) and 9 (pCMV-Myc). Lanes 2 to 7 are from cells expressing JAB1/Myc and JAB1/Myc-HPO (HPOwt, HPOC67S, HPOC70S, HPOC67S/C70S and HPOC90S), respectively. Lane 1 is a control for lane 3 with rabbit mock antibody (normal IgG). A duplicate blot was also probed with anti-JAB1 antibody to monitor the amounts of JAB1 protein (bottom). IP, immuno-precipitation; IB, immuno-blotting.
Pull Down Assay
• 细胞外蛋白质相互作用 • 比较直接地检验蛋白质分子之间存在的物 理的相互作用
• GST-pull down assay • HIS-pull down assay
原理 • 将目的蛋白基因克隆到带有GST或HIS 基因的原核表达载体中，进行原核表 达，得到GST-X或HIS-X融合蛋白。 • 把GST-X挂到Sepharose beads上, 如是 HIS-X 则挂到Ni-chelated agarose上。
Yeast Phenotypes
• Ade–, His–, Leu–, or Trp– Requires adenine (Ade), histidine (His), leucine (Leu), or tryptophan (Trp) in the medium to grow; is auxotrophic for at least one of these specific nutrients. • Ade+ Expresses the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to grow. • His+ Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow. • LacZ+ Expresses the lacZ reporter gene; i.e., is positive for β-galactosidase activity. • Mel1+ Expresses the MEL1 reporter gene; i.e., is positive for α-galactosidase activity.
Figure 2. JAB1 binds to rHPO expressed in E.coli in vitro: rHPO were applied to columns of glutathione beads bearing GST or GSTJAB1.The bound rHPO was eluted together with GST-JAB1, was separated by SDS-PAGE, transferred to PVDF, and detected by anti-HPO antibody. The GST and GST-JAB1 were visualized by Coomasssie blue staining.
30 kD
15 kD
Blot: rHPO GST-JAB1 GST Coomasssie blue stain
GST/HIS 融合蛋白与体外 TNT 系统合成 的多肽或蛋白的相互作用
• 体外TNT系统合成Y，且可在Y上加上标签
• anti-Y antibody 或 标签抗体检测
• X-Y结合力弱时,S32标记 Y,放射自显影
• 然后把 GBD-X 和 GAD-Y 两种载体共转染 到带有报告基因的酵母细胞中。当 GBD-X 融合蛋白中 X 蛋白与 GAD-Y 融合蛋白中 Y 蛋白发生相互作用时（或结合在一起 时），就使得原本分开的 GBD 和 GAD 蛋 白靠近并具有完整的 GAL4 蛋白的功能， 从而能够激活报告基因的表达。
• 加入另一种蛋白Y • 复合物 GST-X---Y (HIS-X---Y) • Wash, elution, detection by SDSPAGE and western blotting.
GST/HIS融合蛋白与重组蛋白的相互作用 • 重组蛋白 • X,Y均为原核表达蛋白 • GST-X---Y，用anti-Y antibody 进行 western blotting 检测
Yeast two-hybrid System
酵母双杂交系统
原理
• 把报告基因整合到酵母细胞基因组中，并 受转录因子 GAL4 的调控表达。一旦 GAL4 蛋白结合到报告基因调控序列相应的位点， 则启动其表达。
• 实际应用中，把 GAL4 基因分成两个部分：DNA结 合区（gal4 DNA binding domain, GBD ）和激活 区(gal4 activating domain, GAD ）。分别把 GBD 和 GAD 构建到两个不同的载体上，并能表达 相应的两个融合蛋白（GBD-X 和 GAD-Y）。 • 自激活作用检测： GBD-X和GAD GAD-Y和GBD 阴性对照 GBD 和 GAD GBD-IL2和GAD-IL2R（例如） 阳性对照
应用
一、阳性: 人为转染重组体 artificial 验证实验:进一步验证实验证明其在生理 情况下是否真的有作用。
二.确定参与结合作用的 domain 或 motif
Co-Immunoprecipitation (co-IP)