细胞传代培养及细胞计数
人癌细胞系传代培养
• 1. 观察：培养细胞生长活跃，占瓶底80%-90%，无污染； • 2.弃废液：倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体； • 3. 漂洗：加1ml 0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消 •
化液； 4. 消化：再加 1ml 消化液漂洗 1 次 , 倒掉大部分消化液 , 保留约0.3ml,室温放置3～5min； 5. 吹打：镜下看到细胞收缩变园 , 加 1 ～ 2ml 含血清培 养液, 用吸管按顺序轻轻吹打，避免出现泡沫； 6. 计数：取样,计数,调整细胞浓度； 7. 接种及培养：按104 细胞/ml接种,37℃、5%CO2 ，饱 和湿度条件下培养。
细胞活力测定－台盼蓝染色法
• 制备单个细胞悬液：105～106／ml • 染色：0.04%台盼蓝染色1 min (9滴细胞悬液 • •
＋1滴0.4%台盼蓝)， 3min 内计数 计数：用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染 料拒染）和死细胞（呈淡蓝色） 计算细胞活力： 活细胞率（％）＝［活细胞数／（活细胞数＋ 死细胞数）］×100
© ¨X 104£ Cell number£
M3SP2 M3SP2-pBp M3SP2-PTEN
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7
8
DT = t × lg2 ÷ (lgNt－lgNo)
培养细胞的纯化方法
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机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞 差速粘附法：成纤维样细胞，上皮样细胞 选择性酶消化法：金属管套取需要的细胞 密度梯度离心法：细胞漂浮密度， Ficoll, Percoll 克隆化培养法：琼脂法，有限稀释法 免疫磁珠分离法：细胞表面标志，免疫磁珠 速度沉降法：细胞大小，离心淘洗技术 电泳分离法：细胞表面电荷
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注意事项
• 细胞生长至覆盖培养瓶底面积 80% 左右时 ,
开始传代。 • 首次传代培养应适当提高接种细胞浓度。 • 细胞混杂生长时, 可根据需要选择合适的 方法纯化细胞。
血球计数板法
• 制备细胞悬液：细胞密度＞104/ml, 细胞过
多时需适当稀释,单个细胞率>95%。 • 加样：混悬细胞，取少许细胞悬液，从计 数池一侧加入，不要溢出或出现气泡。 • 计数：10倍物镜下计数四角大方格内的细 胞，压线者只计左边线和上边线。 • 计算：细胞数/ml=（四大格细胞总数／4） ×104×稀释倍数
细胞密度调整
• 稀释公式：C1· V1＝C2· V2
稀释前细胞密度C1，溶液体积V1 稀释后细胞密度C2，溶液体积V2
Байду номын сангаас 细胞计数
Medium 0.9ml
106/ml
Cell
susspension
105/ml
104/ml
103/ml
0.1ml
0.1ml
0.1ml
细胞生长曲线测定－计数法
80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1
细胞培养过程中常见的问题
• 培养液pH值快速偏离 ：CO2浓度异常，
培养瓶盖过紧 ；细菌、酵母或霉菌污 染 • 培养液出现沉淀 ：细菌或霉菌污染 • 细胞不贴壁 ：胰酶过度消化细胞 ， 支原体污染 ，缺乏附着因子
• 细胞死亡 ：孵箱中缺CO2 ， 孵箱温度
不稳定 ，细胞冻融损伤 ，渗透压改变， 培养液中毒性代谢产物堆积 • 细胞生长缓慢 ：培养液或血清改变 ， 基本促生长成分的消耗、缺乏或降解,如 谷氨酰胺、生长因子等 ，低水平的细菌 或霉菌污染，接种细胞数太少 ，有限培 养细胞衰老 ，支原体污染