Comet assay简介单细胞凝胶电泳技术（Single cell gel electrophoresis, SCGE），又称彗星试验（Comet assay），是在核酸沉淀法（Nucleoid sedimentation）和晕圈分析（Holo assay）等检测技术基础上逐步发展起来的一种在单细胞水平检测有核细胞DNA断裂的新技术。
它主要包括Olive等建立的测定DNA双链断裂的中性单细胞凝胶电泳技术和Singh等建立的测定DNA单链断裂的碱性单细胞凝胶电泳技术。
此技术已经被广泛应用于放射生物学、DNA断裂与修复、毒理学、肿瘤治疗评价、细胞凋亡等领域的研究。
是碱性单细胞凝胶电泳可以检测DNA链的断裂和碱不稳定点，请问碱不稳定点是不是DNA上的脱嘌呤/嘧啶位点呀？还有个问题就是彗星试验检测到的DNA断裂其实是DNA损伤与修复的共同作用的结果，而且DNA修复的一个重要方式就是核苷酸切除修复，因此DNA修复过程也会造成DNA链的断裂，所以彗星试验所反映的时间－效应关系，可能并非与真实的DNA损伤有偏差，因为它无法鉴别修复过程中的DNA断裂。
SCGE技术的原理：细胞核中的DNA为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA双链以组蛋白为核心，盘旋而形成核小体。
一般情况下，偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大，而且不易释放出来，但是，如果用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，DNA 残留而形成类核。
如果类核中的DNA有断裂，断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个DNA晕圈。
将类核置于电场中电泳，DNA断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，故称“彗星试验”。
彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。
此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。
DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。
通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DNA的损伤程度进行定量分析。
随着SCGE技术的发展，可测量的指标也越来越多，而且更准确。
目前，用于SCGE分析的指标主要分为四类，包括形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标。
其中形状指标有彗星细胞率；距离指标包括彗星尾长、彗星全长、彗星头部半径、尾部半径；强度指标包括头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等；矩类指标包括尾矩、Olive尾矩等。
依靠目镜测微尺人工测量彗星距离指标，主观性较强，人为误差较大，而且矩类指标更需要人工通过公式计算得出，使研究人员的工作量加大。
因此，研究人员渴望开发出一种专用的彗星图像分析软件。
近年来，各国研究机构纷纷推出各自的图像分析软件，这些分析软件可以快速提供一系列评价参数，如彗星总长、尾长、尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩等，更好地客观定量DNA损伤。
目前，用于彗星分析的软件包括英国Kinetic Imaging公司的Komet5.5、Perceptive Instruments公司的Comet Assay Ⅲ、LAI公司的LACAAS、美国NIH 的ImagJ、TriTek公司的CometScoreTM、印度原子能研究所的SCGE-Pro、奥地利癌症研究所开发的自动分析软件等。
其中的部分软件可以到其相应网站下载，但最好与相应的彗星分析系统硬件设备配套使用，价格昂贵，提高了研究成本。
新近研发的彗星分析软件（Comet Assay Software Project, CASP）很好地解决了这一问题，该软件可以在普通微机上运行，界面友好，使用方便，分析速度快，可以一次同时给出最多达13个指标，分析结果避免了人为误差，更加客观和准确，结果可以以.txt文件直接输出，SPSS等统计软件可以直接读取其输出结果，便于统计学分析，节省大量人力物力。
中性电泳与碱性电泳在适合的实验条件范围内，没有损伤的细胞在中性或碱性条件都不可能做出尾巴。
中性检测DNA双链断裂，碱性检测DNA单链断裂。
根据实验设计的需要，可以选择不同的实验条件，也可以同时选择两种条件，结果进行对比。
拿电离辐射来说，中性和碱性检测的敏感范围不同，碱性SCGE的敏感范围值偏低，如可以小到0.05Gy，而中性SCGE的敏感范围值偏高，它可能检测不到0.05Gy的DNA 损伤，但可以检测大到100Gy的损伤，而相对中性SCGE来说，碱性SCGE在大剂量照射时的各项指标容易形成平台。
从修复方面来说，双链断裂的修复较单链断裂的修复慢，损伤重，后果更严重，双链断裂是后来形成染色体畸变和微核的主要物质基础。
从文献上来看，药物引起的DNA损伤多采用碱性SCGE 检测单链断裂，A：碱性电泳是在1988年建立的，而最开始彗星方法都是在中性条件下做的（1984），所以我认为，这是方法逐步改进的过程。
碱性条件下，DNA解旋，检测出来的应该是双链和单链断裂的综合损伤，这样可以提高试验的灵敏度，也就是您说的可以检测到0.05Gy,而中性电泳做不到这一点。
B：中性条件跑出来的是DNA的双链，单链断裂不会出来，而强碱性条件下，破坏了断裂部位连接碱基的氢键，这样，双链断裂也就成了单链形式，可以说碱性检测的是“双链和单链断裂的综合损伤”，两种电泳条件的最大区别是适用于不同的实验需求。
碱性条件的SCGE 的建立也是为了满足不同实验需要。
实践中要根据DNA致伤因素选择实验条件，如：电离辐射对DNA的损伤以双链断裂为主，应该选择中性SCGE，而且可以排除环境因素对DNA 损伤的影响（因为DNA很容易受到环境因素的影响而断裂－－单链为主），如果用碱性的话，就不能区分哪些是实验因素引起的断裂，哪些是其它影响因素引起的断裂。
如果实验致伤因素是以DNA单链为主，那就应该选择碱性SCGE了。
有一点需要说明一下，碱性SCGE确实增加了检测的敏感性（中性SCGE达不到），但牺牲了特异性，DNA很容易受许多因素的影响而产生断裂，如吸烟、饮酒等不良生活习惯、环境污染等因素。
所以碱性条件很难从实验结果中剔除哪些是非实验致伤因素造成的，对实验结果会或多或少有点影响。
所以说SCGE条件的选择主要还要根据实验的需要来定。
中/碱性单细胞凝胶电泳Unwinding of the DNA and electrophoresis at neutral pH (7-8) predominantly facilitates the detection of double strand breaks and cross links; unwinding and electrophoresis at pH 12.1-12.4 facilitates the detection of single and double strand breaks, incomplete excision repair sites and cross links; while unwinding and electrophoresis at a pH greater than 12.6 expresses alkali labile sites (ALS) in addition to all types of lesions listed above (Miyamae et al., 1997).Lysis and electrophoresis can be performed in alkaline (option A) or neutral (option B) e option A to detectthe combination of DNA single-strand breaks, double-strand breaks and alkali-labile sites in the DNA, and option B to detectonly DNA double-strand breaks.一．玻片处理1.将玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20 分钟。
2.用热水将肥皂等污物洗去，再用自来水反复冲洗，最后再用蒸馏水冲洗3 ～5 次。
必要时再置95 ％乙醇中浸泡1 小时，然后擦干或烘干备用。
新玻片常有游离碱质，因此应用清洁液或10 ％盐酸浸泡24 小时，然后分别用自来水及蒸馏水彻底洗涤。
3.用无水乙醇提前浸泡磨砂载玻片和盖玻片，至少过夜（用前最好预热下），再使用，可减少脱胶的问题。
bel slide on frosted end using a pencil, not a pen.二至四步均应在暗处进行，以避免额外的DNA损伤performed under dim yellow lights to prevent DNA damagethe premise is that usual lighting will cause DNA damage buthave no data to support this concern.先准备裂解液，加应用液组分溶解至清澈后放冰箱！二．胶的配制与铺设铺胶后都要加盖片（可不加），目的是使胶平整，凝胶固化后移去盖片，再铺另一层，普通波片表面比较光滑，容易脱胶，文献多用毛玻璃片，应该好一点，但也不能完全避免脱胶。
表1.Sample preparation buffer(for plant tissueslicedwith a fresh razor blade)pH7.4配胶用PBS（0.1MpH7.4）用PBS母液配制第一层：0.75％正常熔点胶，100µl，置于室温>5min使其固化在烧杯里配100ml左右的正常熔点琼脂糖，煮沸之后把玻片放进去，让胶液浸过1/3之后，捞出玻片，用布或者别的什么把一面擦干，然后把玻片水平放置，晾干。
*The slides may be air dried orwarmed for quicker drying. Store the slides at room temperature until needed; avoid high humidity（湿）conditions. Wegenerally prepare slides the day before use.*M. Klaude, S. Eriksson, J. Nygren, and G. Ahnstrom (1996) The cometassay: mechanisms and technical considerations. Mutation Res. 363: 89-96.第二层：0.75％低熔点胶，75µl +25µl样品悬液，置于4℃固化1min（也可以把第二层胶配成1％，然后把细胞和胶按照1：1的比例配，这样细胞多了，终浓度也是0.5%）附：三层胶法：Gently slide off coverslip and add a third agarose layer (75 μL LMPA) to the slide. Replace coverslip and return tothe slide tray until the agarose layer hardens (~3 to 5 minutes). Remove coverslip.凝胶不要提前配置，可以提前称量好，分装，用前加PBS至5ml，反复用，效果不好，不易铺平，铺胶前低熔点胶PBS溶解、煮沸，要温于37度水浴箱，再和细胞混合（低熔点琼脂糖在恒温放久了，铺胶染色后会容易造成背景很脏），不会破坏细胞。