分子生物学手段在土壤污染生物修复中的应用摘要: 污染土壤的修复技术主要有物理修复、化学修复和生物修复，文章综述了分子生物学技术包括环境微生物群落降解基因分析、16S rRNA序列分析技术以及荧光原位杂交技术在生物修复技术中跟踪污染土壤中降解微生物行为、监测降解基因和微生物群落变化，揭示了其中的分子机制的应用现状，对各项技术应用中需要注意的问题进行了讨论并对其发展前景进行了展望。

关键词: 分子生物学；降解基因；16S rRNA；FISHMolecular biology techniques in bioremediation of soil: Current status and futureAbstract：This review starts with a brief overview of the molecularbiology techniques applied to the bioremediation of soil. Theprinciples of the catabolic gene probe analysis of microbialcommunity, 16S rRNA sequence analysis and fluorescent in situhybridization (FISH) and their applications to monitoring the fateof contaminant-degrading microorganisms, detecting catabolic geneand analyzing the changes of microbial community in contaminatedsoil are highlighted. The problems and prospects of these techniquesare discussed.Key words: molecular biology; catabolic gene; 16S rRNA; FISH1、引言国家环保总局发布资料指出，目前全国受污染的耕地约有1.5亿亩，污水灌溉污染耕地3250万亩，固体废弃物堆存占地和毁田200万亩，合计约占耕地总面积的1/10以上，全国每年因土地污染造成的经济损失超过2000亿元。

随着我国工农业生产的迅速发展，我国土壤受石油烃类、硝基化合物、多环芳烃、氯代烃、农药、杀虫剂等有机化学品和重金属污染的状况日益严重，对生态环境、食品安全和农业可持续发展构成严重威胁，土壤污染的总体形势相当严峻。

另一方面，全国土壤污染防治的资金投入有限，土壤科学研究难以深入进行。

生物修复技术通过利用和强化环境微生物对难降解污染物的代谢分解作用进行污染控制和治理，在发达国家已形成一定的产业基础，在我国也受到学术界的广泛重视[1]。

土壤是由固相、液相和气相共同组成的三相体系，土壤固相组成及性状复杂，存在于其中的生物群落亦具有高度的不均一性和波动性，土壤生态体系的复杂性加大了生物修复的难度。

具有高效代谢污染物能力的微生物接入污染土壤中，受污染体系温度、水含量、pH值、营养物质供给等因素的不规律剧烈波动，以及土著微生物竞争作用的影响而无法生存，这是制约生物修复技术效率的根本原因[2]。

因此，以分子生物学技术为基础，研究开发在复杂污染体系中快速定量分析具有高效代谢污染物能力的微生物及微生物群落变化的方法，用于指导生物修复的理性设计和过程调控是环境生物修复技术的重要研究方向。

传统的微生物学技术对环境中微生物的分析研究以纯培养技术为基础，工作量大，周期长(数天至数周)，而且由于土壤中90%~ 99.9%的微生物无法进行分离培养[3]，传统的分析技术无法反映微生物群落的真实情况，对不可培养的微生物在污染物生物降解中的作用也无法解析。

另外土壤环境具有显著的地域差异性，依据传统微生物技术及经验进行生物修复过程设计的失败率较高。

1985年Pace等[4]第一次利用rRNA测序技术分析环境中微生物群落以来，分子生物学手段在生物修复技术中的应用目前已成为一个研究热点。

分子生物学技术无需对微生物进行分离培养，具有快速、准确的特点，仅需数小时即可完成检测，具有较大的优越性。

该技术可从分子水平上定量跟踪、监测特定微生物和微生物群落变化，为解析生物修复过程中微生物生态变化与污染防治控制的关系提供了强有力的工具。

本文作者对基于分子生物学技术的微生物群落降解基因分析方法、16S rRNA群落分析技术以及荧光原位杂交技术在生物修复技术中的应用及研究进展进行了综述。

2、环境微生物群落降解基因分析降解基因是指编码污染物代谢途径中主要降解酶的基因片段。

从环境样品中提取DNA样本，利用PCR技术对降解基因进行扩增，得到的结果可用于分析环境中污染物优势降解菌的分布，指导优势降解菌的筛选和生物修复过程的调控。

表1列出了部分典型的降解基因及分子生物学检测方法。

随着研究的开展，越来越多的降解基因被发现，这些降解基因编码有机物代谢途径中的关键酶通过选择合适的分子生物学方法，可在原位检测各类污染物富集的生态环境中降解菌的分布及代谢活性。

降解基因的发现和分子生物学检测方法的开发研究为监控生物修复过程提供了分子水平的理论依据。

Stapleton等[5]将含有BTEX和萘的合成喷气机燃料油注入试验场地的地下水层，用一组基因探针对污染区域中alkB, nahA, nahH, todClC2和xylA基因进行监测，结果表明，在污染区域内形成了好氧降解污染物的微生物群落并对燃料油污染物有较强的适应能力。

Whyte等[6]用PCR杂交和菌落杂交方法分析了4种链烷烃单加氧酶基因型在北极和南极的碳氢化合物污染土壤和对照土壤中的存在特性，由此鉴定出极地链烷烃降解微生物群落中的主要微生物。

对降解基因的定量检测还有助于开发高活性的微生物制剂。

Wang等[7]通过考察菲的主要降解基因，分析了混合微生物在代谢菲时不同代谢途径之间的互补可加速生物降解的可能性。

Cunliffe等[8]考察了采用不同手段预处理接种微生物，发现预处理过程能够显著影响降解基因的表达，进而影响对土壤中多环芳烃的降解效果。

另外，对降解基因的研究还可有助于构建降解能力强的基因工程菌。

应用降解基因监测环境中的优势降解微生物仍面临如下两个关键问题。

第一，已知降解基因序列的有限性，由于大多数基因序列都来自于实验室中易培养的菌株。

根据这些序列设计出来的PCR引物和基因探针只能检测到环境基因库中的某些特定序列。

针对这一问题，需对环境中的代谢基因进行进一步的挖掘，使用定量评估手段也能够避免分析结果的混乱，如使用定量PCR(竞争性PCR或实时PCR)。

第二，为确认降解基因是否真正在原位进行表达，需借助其他检测手段(如反转录酶PCR等)。

3、16S rRNA群落分析技术以16S rRNA为基础的分子生物学技术主要利用不同微生物在16S rRNA 及其基因rDNA序列上的差异对微生物种类进行鉴定和定量分析。

采用该技术无需对环境样品中的微生物进行分离培养，能够快速、准确地反映环境微生物样品的多方面信息。

目前已知16S rRNA基因序列的细菌有10000种以上，并且每年都有新信息不断补充到GeneBank[9]中，这使得微生物研究工作者能够利用这一数据库对微生物群落多样性进行研究。

目前16S rRNA序列分析技术在环境修复领域的应用主要包括3个方面。

第一是鉴定生物降解菌。

如张小凡等[10]从石油污染土壤中分离到2株菲降解菌，经16S rRNA方法鉴定均为鞘氨醇单胞菌属细菌。

Erksson等[11]对一组能够在厌氧环境和很宽的温度范围内降解多环芳烃的菌群进行了分析及鉴定，并分析了富集菌群在不同环境下微生物群落的变化趋势。

Zhang 等[12]采用16S rRNA序列分析从多环芳烃污染的土壤中分离出3株优势降解菌，并首次报道副球菌属细菌对多环芳烃类物质的降解具有通用性。

第二是研究受污染环境中微生物群落多样性的变化，了解种群动态，解析群落与功能的关系，为实现对生物修复过程群落功能的定向调控提供必要的信息。

通过添加营养物质对受高度风化石油烃(C10-C32)污染土壤进行了修复治理，利用16S rRNA基因末端限制性片断分析方法对微生物群落进行了跟踪。

结果显示:在石油烃降解的快速阶段和缓慢阶段，微生物群落中的主要种属发生了很大的变化。

Vanbroekhoven等[13]发现，在不同石油烃类物质污染的土壤中和不同的处理方法下，不动杆菌属微生物的多样性有明显的差异。

Ruling等[14]考察了添加不同的营养物质对石油污染的泥滩中微生物群落的影响，发现添加缓释肥料时石油烃的降解速度较快，该区域中微生物群落中的主要种属与添加液体肥料的区域有明显不同。

以上研究表明营养物质的剂型和添加方式会直接影响微生物群落的变化，进而影响到生物修复的效率。

另外，采用16S rRNA序列分析技术还可以用于检测不可培养的功能性微生物的存在，并指导分离培养技术的改进，从而通过复制自然环境得到这些重要的“不可培养”微生物。

隶属SAR 11进化枝的微生物约占海洋微生物群落的1/4，但在这之前只用16S rRNA序列分析方法检测到它们的存在，未获得纯培养菌株。

Rappe等[15]通过添加海水和低浓度的营养物质分离得到了数株位于SAR 11进化枝上的微生物。

通过提供木聚糖并延长培养时间，也可以从土壤中分离得到从前不可培养的重要微生物。

在分离培养基中添加非营养物质，如环腺普酸，能够改变筛选环境，有利于极端环境中微生物的筛选。

另外还有其他一些方法，如从环境中直接培养或者在实验室制造环境梯度等。

以16S rRNA序列分析技术促进纯种分离培养技术的改进将有助于阐明从环境中检测到的基因的功能和调节方式，得到确定的微生物多样性信息，帮助人们更好地利用白然界中的微生物宝库。

16S rRNA序列分析技术缺点之一是操作过程繁琐，包括样品提取、细胞破碎、核酸提取、PCR扩增、扩增产物分离以及核酸探针设计、应用等，每一步都可能对16S rRNA序列分析结果产生重要的影响，此外该技术无法提供微生物分布的可视化信息。

而荧光原位杂交(FISH)技术在此方面则独具优势。

4、荧光原位杂交(FISH)技术FISH技术采用特殊荧光染料标记核酸探针，在细胞内与特异的互补核酸序列杂交，通过激发探针的荧光来检测信号。

该技术不依赖于PCR，结合了分子生物学方法的精确性、特异性和显微技术的可视性，能够在自然环境中监测和区分不同的微生物个体，评价微生物群落，并同时提供形态学、数量、空间分布以及细胞环境方面的信息。

在微生物学研究中，FISH 技术最常用的靶序列是16S rRNA。