荧光显微镜讲授流程：1、构造2、原理3、发展史荧光显微镜是荧光显微检测的专用工具,它是光学显微镜的一种。
它除了具有光学显微镜的基本结构和光学放大作用外,基于荧光的特性,还具备以下独特的功能要求:(1)提供足够能量的能激发出荧光的光源。
(2)有着适应不同物质所需的激发光谱一组滤色片,从光源中选择合适的激发光谱,使析出的光谱与该物质的吸收光谱重合,以期望获得最大的荧光。
(3)为获得较弱的荧光图像,还要建立一套截止滤色片,它使所需观察的荧光进入系统成像,而将其余的光波,包括发射光阻挡在外,用来提高图像的衬度。
(4)放大的光学系统应适应荧光的特性,最终获得既能观察又能摄影的高亮度、高分辨力的良好衬度的荧光图像。
(5)仪器的安全性。
应用汞灯要防止紫外线的泄漏和汞灯的爆炸,保证电器安全。
滤色片初期用贮放玻璃盒中的有色液体,后改用带色胶质片,由于易变色和使用不方便已被淘汰。
现在经常使用的为色玻璃和干涉滤色片,色玻璃大都属宽波带滤色片,透过波段宽,透过率随厚度而降低,价格相对低廉。
由于色玻璃与空气的界面上,约有4%光线被反射掉,玻片愈多,光能损失愈大,限制了它的使用性能。
干涉滤色片的出现,可按需要制成能透过或截止一定波段的滤色片,从而促使荧光显微术的进展,现代技术上已能对某波段的透射率或反射率进行控制。
荧光显微镜的应用1.在环境中检测已知微生物，制作相应的带有荧光素的抗体，进行标记、定位（免疫荧光技术）对病原微生物的检测有意义--- 梅毒密螺旋体2.荧光显微镜下的细胞增殖（超链接--视频）3.选用不适合同的荧光染色剂，对同一视野下的样品进行染色（复杂环境下）4. 荧光显微镜在各领域中的应用都非常广泛,在植物细胞的观察研究中,通过染色可以更清晰地观测到细胞的形态及结构。
在实验中发现,荧光显微镜还可以直接(不做任何处理)观察植物叶的气孔器,而且能观察到气孔的变化情况,为荧光显微镜找到了一种新用途。
5. 20世纪30年代荧光染色即已用于细菌、霉菌等微生物及细胞、纤维等的形态观察和研究。
如用抗酸菌荧光染色法可帮助人们在痰中找到结核杆菌。
40年代创造了荧光染料标记蛋白质的技术,这种技术现已广泛应用于免疫荧光抗体染色的常规技术中,可检查和定位病毒、细菌、霉菌、原虫、寄生虫及动物和人的组织抗原与抗体,可用以探讨病因及发病机理,如肾小球疾病的分类及诊断,乳头瘤病毒与子宫颈癌的关系等6.在植物细胞凋亡机理的研究中对线粒体进行染色后,用荧光显微镜能够很清晰地观察到活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光;凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
利用荧光标记技术显示微管,可以在多种植物生殖细胞内清楚地看到微管骨架的存在7.在紫外光激发下,叶绿体发出火红色荧光,气孔发绿色荧光,保卫细胞呈黄色或黄绿色,且形状大小非常清晰,两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。
表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少,所以在荧光显微镜下看不到表皮细胞。
通过大量试验证明,单子叶,双子叶,裸子植物大都适用于这种方法而且效果较好。
荧光显微镜基本形式有两种:透射式和落射式。
透射式如图8所示,它由光源(HL)、激发滤色片(EF)和照明系统供给激发光。
图中用暗场聚光镜(DC)将光束会聚在切片(P)上,由物镜(OB)将荧光物成像于像面上,截止滤色片(SF)吸收被切片衍射的杂散激发光,仅透过荧光到目镜(OC)。
DC—暗场聚光镜; OB—物镜; SF—截止滤色片; OC—目镜。
图8透射荧光显微镜透射式备有明场聚光镜和暗场聚光镜。
明场聚光镜很少直接用于荧光检测中,常用来搜索目标,寻找或挑选切片需要的区域,这是费时的工作,不宜用强度极高的光去完成,否则会出现衰减甚至猝灭,当仪器配备高质量短波通干涉滤色片激发时,用明场聚光镜,在调节可变光适当时,也可获得满意的荧光图像。
暗场聚光镜在透射荧光中是必备的,由于使用暗场聚光镜激发光不会进入物镜,背景呈“暗”色,使荧光衬度大大提高。
荧光中应用的暗场聚光镜材料应选用自发荧光少的硝酸盐,并且能透过紫外线的材料。
图9所示是一种心形暗场聚光镜,它的心脏形反射面将光线高度会聚成一“点”,聚光镜的性能可用下式表征。
E=KõP(NA2max-NA2min)K为透过率。
可见其性能取决于聚光束最大数值孔径与最小数值孔径的平方差,差值愈大,性能愈优越。
暗场是用中空的光锥激发切片的荧光物,为得到稳定的荧光图像,聚光镜的调节机构(对中和调焦)应稳定可靠,可多次重复照明条件。
另外在使用时应注意切片的厚度,一般在0.8mm～1mm之间才获得暗场效应,这是因为受到暗场光锥顶点深度的限制。
好的暗场聚光镜,1.2mm的厚切片也能使用。
图9心形暗场聚光镜落射式如图10所示。
它将激发光由二向色分光镜(DM)反射通过物镜射至切片上激发荧光物。
二向色分光镜能通过物镜收集荧光。
截止滤色片吸收激发光谱的反射光让荧光色透过从目镜中观察。
DM—二向色分光镜图10落射荧光显微镜二向色分光镜是落射式关键部件,它是多层膜干涉滤色片,与主光路呈45°安置,它的光谱特性如图11所示。
该曲线竖轴为透过率,横轴为波长,其反射率可用100%与透过率差值求得,从380nm～400nm的波长(青色)约90%反射,520nm以上的光波从(黄至红色)透过。
以50%的反射率时的波长作为表征,如该曲线为500nm,记为DM-500。
图11二向色镜透射曲线图12落射照明光路各个分色镜还应建立相应的激发和截止滤色片,以满足不同的需要。
滤色片(包括二向色分镜)的设置与组合是荧光显微镜设计中一个重要的课题,它与荧光术的应用密切相关。
落射式激发光通过物镜垂直自上而下照明切片上表面,故又称为垂直照明器,它采用柯勒照明系统。
光源经集光镜大致成平行光束,为利用光能,增大包容角,用隔热玻璃吸收热线,聚光镜使光源成像于孔径光阑上,并使它与物镜后焦面重合,所以经物镜出射激发光束为平行光均匀投射到切片上。
要注意的是仪器配备的所有物镜均应达到此要求。
这两种基本形式,各有特点和使用价值。
对于落射式:(1)物镜兼作聚光镜,就没有聚光镜的定中与调焦问题,而且物镜的数值孔径随倍率而增大,荧光图像亮度也随之提高;(2)激发光不必透过载玻片,因而减少损失,而且激发光与荧光对物镜而言方向相反,分得很开不可能产生互相干扰,就是有部分反射激发光进入物镜后也被二向色分光镜反射至光源,仅有极小部分透过,使截止滤色片负担小,可制成较薄的片;(3)用透射式激发时,大部分荧光产生于切片底部,必须透过切片射出,而且还会产生散射。
而落射照明和观察面在同一表面,荧光图象亮度毫无损耗,而且对象质也无影响,特别对厚的切片,如菌落和组织培养等更具有独特的功能;(4)落射荧光的物镜因要通过紫外区光谱,因此必须要考虑紫外段的透过率,为此专门研制UV-F透紫外区荧光物镜系列,而透射式则不必。
对于透射式,在UV,U激发时一般用优良的消色差物镜即可,在可见光B与G激发时,用半复消色差或复消色物镜最为合适,用齐明物镜也可以,虽然齐明物镜象场不平,然而高倍物镜用于对边缘分辨力要求不高的试样。
一般中等以下倍率,干物镜适用于暗场照明。
高倍率的浸液物镜不适合暗场照明,因为暗场聚光镜照明锥光束会进入物镜。
浸液式物镜比干镜头更适宜作落射照明,因为空气—玻璃界面反射光远比玻璃—浸液界面反射光多。
对于目镜没有特殊要求。
由两种基本形式组合,具有更大机动性,适应各种研究需要。
图13(a)(b)中透射(明场或暗场)用来搜索定位,也可以用来比较荧光部位和不发荧光部位的细微结构;(d)和(e)也有相同的功能。
(d)中使用相衬时,要用相衬物镜,交替进行荧光观察和相衬观察,进行比较;(e)中偏光观察适用于双折射物质,(c)中落射荧光和透射荧光的组合适用于双重染色,如同时进行FITC和TRITC双重染色,则可用落射观察TRITC,用透射观察FITC标识过的部位。
·28·光学仪器第23卷另外在使用时应注意切片的厚度,一般在0.8mm～1mm之间才获得暗场效应,这是因为受到暗场光锥顶点深度的限制。
好的暗场聚光镜,1.2mm的厚切片也能使用。
图9心形暗场聚光镜落射式如图10所示。
它将激发光由二向色分光镜(DM)反射通过物镜射至切片上激发荧光物。
二向色分光镜能通过物镜收集荧光。
截止滤色片吸收激发光谱的反射光让荧光色透过从目镜中观察。
DM—二向色分光镜图10落射荧光显微镜二向色分光镜是落射式关键部件,它是多层膜干涉滤色片,与主光路呈45°安置,它的光谱特性如图11所示。
该曲线竖轴为透过率,横轴为波长,其反射率可用100%与透过率差值求得,从380nm～400nm的波长(青色)约90%反射,520nm以上的光波从(黄至红色)透过。
以50%的反射率时的波长作为表征,如该曲线为500nm,记为DM-500。
图11二向色镜透射曲线图12中激发滤色片从高亮度的汞灯(或氙灯)中主要透过绿光,经双色分光镜反射至物镜,落射照明切片,其中一些激发光在盖玻片和物镜表面反射回去,被截止滤色片吸收,只有切片发出的橙色荧光,才能透过进入目镜。
二向色分光镜将光源发出的光谱分为两段(故称二向色),一段反射作为激发光,一段透过荧光。
显然二向色分光光谱段太宽,还必须配备激发滤色片和附加的截止滤色片适应荧光观察。
为了覆盖光谱区应设置多少二向色分光镜?一般分4个波段,如用DM-400、DM-445、DM-505和DM-575为一组。
近年来,有的厂家又细化些,配置6个分色镜,它们是DM-400、DM-430、DM-455、DM-505、DM-575和DM-595。
·27·第2期杨广烈:荧光与荧光显微镜荧光显微镜基本形式有两种:透射式和落射式。
透射式如图8所示,它由光源(HL)、激发滤色片(EF)和照明系统供给激发光。
图中用暗场聚光镜(DC)将光束会聚在切片(P)上,由物镜(OB)将荧光物成像于像面上,截止滤色片(SF)吸收被切片衍射的杂散激发光,仅透过荧光到目镜(OC)。
DC—暗场聚光镜; OB—物镜; SF—截止滤色片; OC—目镜。
图8透射荧光显微镜透射式备有明场聚光镜和暗场聚光镜。
明场聚光镜很少直接用于荧光检测中,常用来搜索目标,寻找或挑选切片需要的区域,这是费时的工作,不宜用强度极高的光去完成,否则会出现衰减甚至猝灭,当仪器配备高质量短波通干涉滤色片激发时,用明场聚光镜,在调节可变光适当时,也可获得满意的荧光图像。
暗场聚光镜在透射荧光中是必备的,由于使用暗场聚光镜激发光不会进入物镜,背景呈“暗”色,使荧光衬度大大提高。
荧光中应用的暗场聚光镜材料应选用自发荧光少的硝酸盐,并且能透过紫外线的材料。
图9所示是一种心形暗场聚光镜,它的心脏形反射面将光线高度会聚成一“点”,聚光镜的性能可用下式表征。