亲和萃取、沉淀和 分离技术
6.1 亲和萃取 6.2 亲和沉淀 6.3 亲和膜技术 6.4 分子印迹分离技术 6.5 亲和反胶团萃取技术
6.1 亲和萃取
➢ 亲和萃取简介 ➢ 亲和配基高聚物的合成 ➢ 亲和分配的影响因素和亲和模型 ➢ 亲和分配的应用
6.1.1 亲和萃取简介
萃取是一种常见的生化分离技术，生化分离 技术的萃取技术包括双水相萃取、反胶团萃取等。 亲和萃取就是将亲和层析的亲和配基用于萃取分 离中，包括亲和双水相和亲和反胶团等。
亲和萃取简介
常用的亲和配基、双水相体系和它们所对应分离的物质
分离蛋白
白蛋白
亲和配基
脂肪酸
碱性磷酸化酶
Procion red HE-3G
共脂肪酶（Colipase）
卵磷脂Lecithin
脱氢酶，激酶
活性染料
α-2-巨球细胞
Cu2+
体系
PEG/dextran
PEG/dextran, PEG/ 盐
PEG/dextran PEG/dextran,
➢ 一次作用亲和沉淀作用机理与抗原－抗体的沉淀作用相 似。存在着配基与蛋白质的结合部位的最优化使沉淀率 最高。
一次作用亲和沉淀
➢ 一次作用亲和沉淀虽然简单，但仅适用于多价、特别 是4价以上的蛋白质
➢ 要求配基与目标分子的亲和结合常数较高 ➢ 沉淀条件难于掌握，并且沉淀的目标分子与配基的分
离需要凝胶过滤等难于大规模应用的附加工具，实用 上存在较大难度。 ➢ 另外，在一次作用亲和沉淀这常用的多配基染料有配 基自交联(ligandself-assoliation)的现象，成为交 联网络形成的竞争机制，从而阻碍了沉淀的生成。所 以人们更多是采用二次作用亲和沉淀。
目标蛋白质的结合位点不被配基－聚合物饱和时
K C K P 1 ( C L k d ) 1 N1 ( C L k d ) 2 N
6.1.4 亲和分配的应用
➢ 乳酸脱氢酶（LHD）的亲和分配
6.1.4 亲和分配的应用
➢ 葡萄糖-6-磷酸化脱氢酶（G6PDH）的纯 化
6.1.4 亲和分配的应用
亲和沉淀的机理：
配体的连接
加到含有目标 分子得溶液中
特异性结合 目标分子
亲和沉淀原理图
形成 亲和沉淀
目标分子 解离
亲和沉淀的优点
➢ 溶液中进行，无扩散传质阻力和结合时的空间位阻， 亲和结合速度快，结合充分；
➢ 亲和配基裸露在溶液中，配基利用率高； ➢ 利用成熟的离心或过滤技术回收沉淀，易于规模放
大 ➢ 亲和沉淀法可用于高粘度或含微粒的料液中目标产
G 1RlTnkd()1
G 4RlTnkd()2
G 2RlTnKL
G3 RTlnKp
G5RT lnKc
亲和分配的影响因素和亲和模型
推导得
K c (k d )2 K L(k d )1K P
有N个结合位点的蛋白质而言
K C(k d)2K L(k d)1N K P
lo K m g a lx o K C g K P ) ( N lo K Lg
PEG/ 盐
PEG/dextran
S-23 骨髓瘤蛋白
二硝基酚
PEG/dextran
3-氧代类固醇异构酶 胰蛋白酶
雌甾二醇l 对氨基苯咪
PEG/ dextran PEG/dextran
6.1.2 亲和配基高聚物的合成
亲和双水相中亲和配基可固定在上相高聚物或下相 高聚物上，甚至亲和配既可以以游离状态分配在体系 中。
一般配基固定在上相高聚物上，即将亲和配基通过 化学方法结合在PEG上。
主要包括以下两种:
PEG 的活化 亲和配基直接反应
6.1.3 亲和分配的影响因素和亲和模型
影响亲和分配的影响因素包括普通双水相的影响因素如 PEG浓度，还有:
配基浓度 配基载体 染料配基 pH: 增加，效率降低 温度: 升高，效率降低 盐浓度
➢ 葡萄糖-6-磷酸化脱氢酶（G6PDH）的纯 化
6.2 亲和沉淀分离技术
➢ 亲和沉淀的原理 ➢ 亲和沉淀聚合物和亲和配基
亲和沉淀可逆性聚合物 亲和沉淀亲和配基 ➢ 亲和沉淀的展望
6.2.1 亲和沉淀的原理
亲和沉淀(Affinity precipitation)是将生物专一性 识别与沉淀分离相结合的纯化技术。
亲和分配的影响因素和亲和模型
盐的种类
磷酸钠（添加） 甲酸钠，pH7 醋酸钠，pH7 丙酸钠，pH7 Na2SO4 KCl Li2SO4 Tris，pH7 KI NaSCN 临苯二甲酸钾 NaClO4
盐对分配系数的影响
添加盐时的△log K占不添加盐时的百分数（％）
25mM 100
63mM 103
250mM ——
物 的纯化，可在分离操作的初期进行，这对目标分子是 极其有利的：因为粗料液中通常含有对目标产物有害 的杂质（如蛋白酶）。快速、有效地将目标产物分离 出来，有利于提高产品的质量和收率
亲和沉淀机理
亲和沉淀的机理分为两种 ➢ 一次作用亲和沉淀
(primary-effect precipitation) ➢ 二次作用亲和沉淀
——
——
88
105
97
81
——
——
89
98Hale Waihona Puke 8533104
80
21
——
77
——
——
76
——
97
69
1
——
67
——
——
48
——
——
42
——
亲和分配的影响因素和亲和模型
体系中的目标蛋白质被配基分子饱和时
亲和分配的影响因素和亲和模型
整个过程的自由能变可以列成如下算式
ΔG5＝ΔG1＋ΔG2＋ΔG3＋ΔG1
(secondary-effect precipitation)
一次作用亲和沉淀
➢ 水溶性化合物分子偶联有两个或两个以上的亲和配基， 即双配基(bis-ligand)和多配基(polyligand)
➢ 通过与多价蛋白质(multivalent protein)支联，在适 当的条件下，形成较大的支联网络而沉淀。
二次亲和沉淀分离蛋白质示意图
6.2.2 亲和沉淀聚合物和亲和配基
典型的亲和沉淀有以下步骤：
① 亲和沉淀介质的制备 ② 将亲和沉淀介质加入含有目标蛋白质或酶的粗液中 ③ 聚合物－亲和配基－目标蛋白的沉淀: 通过降低聚合物的
二次作用亲和沉淀
➢ 制备亲和沉淀介质:利用在物理场如pH、离子强度、 温度等改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶 性聚合物为载体固定亲和配基。
➢ 亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质 与目标分子共同沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀。
➢ 离心或过滤回收沉淀，即可除去未沉淀的杂蛋白。 ➢ 沉淀清洗后加入洗脱剂即可纯化目标产物。