高压蒸气灭菌 高温干热灭菌 棉塞 超净工作台等
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•接种操 作
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二、用固体培养基分离纯培养
菌落：单个微生物在 适宜的固体培养基表 面或内部生长、繁殖 到一定程度可以形成 肉眼可见的、有一定 形态结构的子细胞生 长群体。
菌苔：当固体培养基 表面众多菌落连成一 片时，便成为菌苔。
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菌落
无菌水、梯度稀释、50℃左右的琼脂培养基、灭过菌 的培养皿。注意要稀释得当。
分离出单个菌落以后，重复上述操作数次，便可得到 纯培养。
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•稀释倒平板法
Pour plate
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涂布平板法
无菌水、梯度稀释 涂布平板
•Spread plate
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稀释倒平板法和涂布平板法
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平板划线分离法
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稀释摇管法
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第二节 显微镜和显微技术
显微镜的种类及原理 显微观察样品的制备
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一、显微镜的种类及原理
普通光学显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 荧光显微镜 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 扫描隧道显微镜
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普通复式光学显微镜
普通生物显微镜由三部分构成： ➢ 照明系统：包括光源和聚光器。 ➢ 光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显 微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜 和物镜都由复杂的透镜组构成。 ➢ 机械装置：保证光学系统的准确配制，用 于固定材料和观察方便。
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件 ，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大 增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。
富集条件：物理、化学和生物等。以从土壤中分离能降解酚类化合物对 羟基苯甲酸的微生物的实验为例。
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六、微生物的保藏技术
菌落或菌苔是对微生物进行分类和鉴定的重要依据。
•细菌菌落特征剖面图
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菌落
•细菌菌落特征正面图
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培养平板
培养平板（平板）：指熔化的固 体培养基倒入无菌平皿，冷却凝 固后，盛有固体培养基的平皿。
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平板分离微生物纯培养技术
稀释倒平板法 涂布平板法 平板划线分离法 稀释摇管法
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1、稀释倒平板法：
用于分离严格厌氧菌。先将一系列盛有无菌琼脂培养基 的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待 分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均 匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固 体石蜡的混合物，将培养基与空气隔开。
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三、用液体培养基分离纯培养
用于细胞大的细菌、原生动物和藻类等的 纯化分离。
第二章微生物的纯培养 和显微技术
2020年7月9日星期四
第一节 微生物的分离和纯培养
无菌技术 用固体培养基分离纯培养 用液体培养基分离纯培养 单细胞（单孢子）分离 选择培养分离
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一、无菌技术
无菌技术：在分离、转接及培 养纯培养(物)时防止其被其他 微生物污染的技术。
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保持无菌的方法
。 橡皮塞封口或用石蜡覆盖，并放置低温
保存。 4℃保。
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2、冷冻保藏
代谢作用停止。 细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比
有细胞壁敏感。其原因是低温会使细胞内水分形成冰晶， 从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。 速冻及快速解冻可减少损伤；还可加一些保护剂，如0.5% 左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过降低强烈的脱 水作用而保护细胞； 大分子物质因此在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各 种保护剂以提高培养物的存活率。
保藏期间微生物不死亡、不污染、不会因发生 而丢失重要的生物学性状。
许多国家都设有相应的菌种保藏机构：
中国微生物菌种保藏委员会 美国典型菌种保藏中心 世界菌种保藏联合会等
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菌种保藏
菌种保藏：就是根据菌种特性及保藏目的 的不同，给微生物菌株以特定的条件，使 其存活而得以延续。
对于生产中使用的菌种保藏培养基， 要求比较丰富的氮源，以防止菌种退 化变质。
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冷冻真空干燥保藏
是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在 真空下通过水的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在 真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物 处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以 达到长期保藏的目的。
用水升华的方式除去水分，手段比较温和，细胞受损伤的 程度相对比较小，存活率及保藏效果均不错，是目前使用 最普遍，也是最重要的微生物保藏方法。
稀释法：经高度稀释后，同一个稀释度的 试管中大多数（95%以上）表现不生长，很 可能得到的是纯培养。
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四、单细胞（单孢子）分离
单细胞分离：采取显微分离法从混杂群体中直接 分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养 。
单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比 。个体较大的可在低倍显微镜下进行，个体较小 的则需采用显微操作仪。
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五、选择培养分离
当某一种微生物所存在的数量与其他微 生物相比非常少时，单采用一般的平板 稀释方法几乎是不可能分离到该种微生 物的，故需采用选择培养分离法。
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1、利用选择培养基进行直接分离
如要分离高温菌，可在高温条件进行 培养；要分离某种抗生素抗性菌株， 可在加有抗生素的平板上进行分离。
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2、富集培养
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3、干燥保藏法
沙土管保存和冷冻真空干燥保 藏是最常用的二项微生物干燥 保藏技术。
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沙土管保存
一般将菌种接种至斜面，培养至长出大量的 孢子后，洗下孢子制备孢子悬浮液，加入无 菌沙土试管中，减压干燥，直至将水分抽干 ，最后用石蜡、橡胶塞等封闭管口，置冰箱 保存。此法主要适用于产孢子的微生物，如 芽孢杆菌、放线菌等，保藏时间相对较长。
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菌种保藏方法
连续移接 改变条件（干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）
使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到 半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得 到保藏，有的可保藏几十年或更长的时间。 在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物 恢复活力。
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1、传代培养保藏
是微生物保存的基本方法。 琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培养等
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分辨率
重要性能参数。 显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，
还与显微镜的分辨率（resolution）有关。 分辨率是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm
处）能分辨物体最小间隔的能力。 分辨率的大小决定于光的波长和镜口角以及