免疫组化方法（冰冻切片）
A. 所需溶液和试剂
1.二甲苯
2.无水乙醇（100% 和95%，变性无水乙醇，组织学级）
3.苏木精（可选）
4.固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。

a.10%中性福尔马林
b.丙酮
c.甲醇
d.3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X
PBS中。

5.10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma
base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。

用浓盐酸将pH调节到7.6。

6.漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。

100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。

7.甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。

保存在-20°C。

8.封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。

9.配制时，将500 µl山羊血清和30 µl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。

10.检测系统：根据厂家说明书使用。

已有的检测系统*。

11.DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。

B. 切片
1.对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。

这可以避免切
片时样品断裂。

2.将样品切成大约6-8 µm厚，铺在带正电性的玻片上。

3.固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。

（这有助于切片贴紧玻片）
C. 固定
注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂
1.玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。

a.10%中性福尔马林：室温10分钟。

立即进行染色操作。

b.冰丙酮：-20°C 10分钟。

风干。

立即进行染色操作。

c.甲醇：-20°C 10分钟。

立即进行染色操作。

d.3%甲醛溶液：室温15分钟。

立即进行染色操作。

e.3%甲醛/甲醇：先在室温下3%甲醛中固定15分钟，然后在-20°C的
甲醇中固定5分钟（中间不漂洗）。

立即进行染色操作。

D. 染色
1.切片用漂洗液洗两次，每次5分钟。

2.室温下，浸泡在3% H202/甲醇中孵育10分钟
3.用漂洗液洗两次，每次5分钟。

4.在切片上滴加封闭液，室温封闭1小时。

5.按抗体说明书的推荐比例将抗体稀释在封闭液中。

6.去掉切片上的封闭液，每个切片上加100-400 µl稀释的一抗。

4°C孵育过夜。

7.去掉抗体。

用漂洗液洗3次，每次5分钟。

8.根据厂家说明书，用合适的检测系统*检测。

9.用漂洗液洗3次，每次5分钟。

10.加入100–400 µl DAB或合适的底物，近距离检测染色进展。

11.一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中。

12.如有需要，将切片泡在苏木精溶液中复染，按照产品说明进行。

13.切片用蒸馏水洗两次，每次5分钟。

14.切片脱水：
a.在95%乙醇中孵育两次，每次10秒。

b.在100%乙醇中孵育两次，每次10秒。

c.在二甲苯中孵育两次，每次10秒。

15.加上盖玻片。