实验七高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯
一.实验目的
1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。
2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。
3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。
二.实验原理
高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。
在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。
反之，则称为正相色谱分离系统。
反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。
定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
分离度（R）的计算公式为：
R＝ 2[t
(R2)-t
(R1)
] /1.7*(W
1
＋W
2
)
式中 t
(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t
(R1)
为相邻两峰中前一峰的保留
时间； W
1及W
2
为此相邻两峰的半峰宽。
除另外有规定外，分离度应大于1.5。
本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。
它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。
但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。
待测物性质见表1。
表1色谱柱测试条件
如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂
1、仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。
2、试剂
甲醇（色谱专用），高纯水
四.实验步骤
1、色谱条件
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8）
柱温：室温
流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％
检测器：DAD检测器;
检测波长：220nm；
进样体积：100µl定量环，实际注射每次可控制在200µl。
2、待测溶液的配制
首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。
然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。
3、色谱测定
(1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。
流量为1.000ml/min。
(2) 待仪器稳定后，开始进样。
将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。
(3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。
(4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。
依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。
五.实验结果
（1）流动相的比例为：高纯水：20%甲醇：80%，流速为1.0ml/min ，记录色谱图，并计算分离度； 012345
1000
2000
3000
4000
5000
6000
m A U min
根据分离度公式：计算分离度：R 1==2.466，R 2==13.92
（2）流动相的比例为：高纯水：20% 甲醇：80%；流速为0.5ml/min ，记录色谱图，并计算分离度；
0246810
1000
2000
3000
4000
5000
6000
m A U min
根据分离度公式：计算分离度：R 1==3.136，R 2==17.29
（3）流动相的比例为：高纯水：30％，甲醇：70％，流速为1.0ml/min ，记录色谱图，并计算分离度；
-20246810121416
1000
2000
3000
4000
50006000
m A U min
根据分离度公式：计算分离度：R 1==5.991，R 2==37.65
（4）定性过程（混合物和DEP ）：实验得到如下的色谱图下：
012345
1000
2000
m A U min
由图可以看出，混合溶液的出峰顺序为：邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯。
六.思考题
（1）比较图2和图3可知，在缓冲液作流动相的情况下，实验得出的峰形较好。
但为什么实验室尽量不用缓冲溶液作流动相？
图2 缓冲液作流动相得出的色谱图
图3 乙腈-水（5：95）作流动相得出的色谱图
答：因为缓冲溶液对色谱柱的损伤较大，使用后，不易清洗，成本高，并且这种对色谱柱固定相及键合相的破坏通常是不可修复的。
（2）流动相在使用前为什么要用砂芯漏斗过滤？
答：HPLC要求流动相非常的纯净，否则他会对色谱柱和仪器产生不可逆损坏。
由于色谱柱填料颗粒很细，内腔很小，流动相中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管堵塞；而仪器进样阀也易被小颗粒堵塞，因此流动相在使用前要用砂芯漏斗过滤。
（3）请分析实验结束后，怎样清洗柱子。
分为两种情况，第一种情况为流动相用到缓冲溶液，第二种情况为流动相不用缓冲溶液？
答：分析实验结束后，先将体系中盐分去除干净，再依次用甲醇：水（60：40）、甲醇：水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗清洗柱子，并最后灌满。
对于不用缓冲溶液：以20倍柱体积或更多一些的强溶剂加以清洗。
可以在甲醇、乙腈等水溶性溶剂之后，改用50%DMSO或DMF水溶液加以清洗。
清洗几十倍柱体积后，再逐步置换返回原系统
（4）根据实验结果分析，流动相中水的比例多少对分离度、出峰时间的影响及流速对分离度的影响。
答：根据实验结，可以看出，流动相中水的比例越高（或甲醇比例越低），流速越小，分离度越高，出峰时间越晚；水的比例减小，分离度也减小，但出峰时间加快。
所以应选择一个合适的流动相比例。